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背景肝癌是指发生于肝脏的恶性肿瘤,死亡率极高,主要可分为原发性肝癌和继发性肝癌,其中原发性肝癌是肝癌的主要类型。原发性肝癌(primary liver cancer,PLC)主要由肝脏内的细胞发生癌变所引起,可分为肝细胞型、胆管细胞型和混合型,其发病率和死亡率正在逐年增加,其中肝细胞型约占原发性肝癌中的85.5%。在中国,原发性肝癌是危害程度最高的恶性肿瘤,每年死于该病的大约为54万人。因此,对肝癌的预防和治疗的研究具有重要的科学意义和临床价值。硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)是一种具有臭鸡蛋气味的有毒气体,近年来的研究表明,H2S能够在机体内由硫化氢合成酶内源性合成,并且在机体的生理病理过程中发挥作用,它是机体内继一氧化氮和一氧化碳之后的第三种气体信号分子。实验证明,H2S在肿瘤发展的生物进程中发挥着重要的作用。但是,关于H2S对肿瘤的作用还存在争论,一种观点认为H2S能够促进肿瘤细胞的增殖;另一种观点认为H2S能够抑制肿瘤细胞的生长。为了澄清这一争论,本课题将以人肝癌细胞为模型系统的探讨H2S对肿瘤的作用。目的研究硫化氢对人肝癌细胞生长的影响和潜在的作用机制。方法1、体外实验1.1 MTT实验通过MTT实验,对人正常肝细胞L02、人肝癌细胞系SMMC-7721和Huh-7细胞给予0μM、10μM、25μM、50μM、100μM、200μM、400μM、600μM、800μM、1000μM的NaHS诱导24h。通过在酶标仪上测定每组细胞的OD值,来检测硫化氢对细胞的增殖的影响。OD值越大,细胞的增殖水平越高。1.2细胞迁移实验通过细胞划痕实验,对人正常肝细胞L02、人肝癌细胞系SMMC-7721和Huh-7细胞给予0μM、10μM、25μM、50μM、100μM、200μM、400μM、600μM、800μM、1000μm的nahs诱导24h。分别在0,12,24h时拍照,通过分析划痕的愈合情况来评估硫化氢对肿瘤细胞迁移的影响。1.3westernblot检测用westernblot检测不同浓度nahs对肿瘤细胞中的bax、bcl-2、caspase-3、cleavedcaspase-3、akt、pakt、erk、perk、pten、mmp-2、egf、pegf蛋白的表达水平的影响。1.4tunel染色和dapi染色利用tunel染色观察不同浓度nahs刺激下人肝癌细胞的凋亡情况。同时进行dapi染色,便于计算每组细胞的凋亡率。2、体内实验2.1肿瘤模型的建立、实验分组和给药肿瘤模型的建立:将人肝癌细胞(smmc-7721和huh-7)按每只裸鼠注射5×105个细胞,在裸鼠右侧腋窝下经皮下注射的方式接种。24h后,成瘤率100%,肿瘤模型建立成功。实验分组及给药:造模成功后,将裸鼠按体重进行分组,实验组分别注射不同浓度nahs(10μm、25μm、50μm、100μm、200μm、400μm、600μm、800μm、1000μm),阴性对照组注射同等体积的生理盐水代替nahs。每天相同时间点由瘤旁注射给药一次,共给药14天。整个实验过程中,每天测量实体瘤的长和宽,用来评估h2s对实体瘤生长的调控。2.2组织学形态观察通过肿瘤组织的he染色检测h2s对实体瘤生长的调控。利用血管新生的标记物cd34对肿瘤组织进行免疫组织化学染色,观察不同处理组中肿瘤组织的血管新生情况。2.3毒性评估实验通过分析荷瘤裸鼠的体重以及心、肝、脾、肺、肾和脑的重量变化,检测各组间白细胞的数量,观察心、肝、脾、肺、肾和脑组织切片的he染色来评估h2s荷瘤裸鼠的毒性。结果1、mtt和细胞划痕实验结果显示,0-1000μm的nahs对正常肝细胞的生长无明显的影响(p>0.05);但对人肝癌细胞(smmc-7721和huh-7)而言,与阴性对照组相比,10-100μM的NaHS能够显著的促进人肝癌细胞的增殖和迁移(P<0.05),600-1000μM的NaHS对人肝癌细胞的生长和迁移有显著的抑制作用(P<0.05)。2、TUNEL染色和对凋亡蛋白的检测结果表明,与阴性对照组相比,25-100μM的NaHS可以明显抑制肿瘤细胞的凋亡(P<0.05),600-1000μM的NaHS能显著促进肿瘤细胞的凋亡(P<0.05)。3、与阴性对照组相比,Western blot结果显示,低浓度的H2S可以诱导EGFR、AKT和ERK的磷酸化水平升高(P<0.05),而高浓度的H2S可以抑制EGFR、AKT和ERK的磷酸化(P<0.05)。4、所有裸鼠接种人肝癌细胞成功,成瘤率100%,成功建立荷瘤裸鼠模型。5、肿瘤组织的HE染色结果显示,与阴性对照相比,10-1000μM的NaHS范围内,肿瘤组织内的细胞的增殖呈现出先上升后下降的趋势。6、免疫组织化学结果显示,与阴性对照组相比,10-100μM NaHS组的微血管密度(microvessel denisity,MVD)明显升高(P<0.05)。在600-1000μM NaHS组的微血管密度显著降低(P<0.05)。7、HE染色结果显示各组裸鼠的心、肝、脾、肺、肾等器官无明显形态学差异,裸鼠血液中白细胞总数及心、肝、脾、肺、肾和脑的重量指数表明各组之间无统计学差异(P>0.05)。结论1、低浓度H2S(25-100μM)对人肝癌细胞有促进其生长和抑制其凋亡的作用。2、高浓度H2S(600-1000μM)对人肝癌细胞有抑制其生长和促进其凋亡的作用。3、低浓度的H2S能够增强肝癌细胞中EGFR的活性,并上调pERK和pAKT的表达,从而诱导人肝癌细胞的增殖,高浓度的H2S通过减弱pEGFR、pAKT和pERK的活性促进细胞凋亡。4、低浓度H2S通过诱导实体瘤中的血管新生促进肿瘤的生长,而高浓度的H2S则抑制了血管新生,从而诱导实体瘤内细胞的死亡。5、本研究所用的NaHS浓度(10-1000μM)对荷瘤裸鼠并没有表现出明显的毒性。