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目的:胃癌是严重威胁人类生命的恶性肿瘤之一,多个研究表明miR-33b与骨肉瘤、乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤发生发展相关,参与了肿瘤的增殖、转移等生物学过程的调控,还通过调节靶基因与信号通路调控网络相关。本研究目的是阐述miR-33b在胃癌发生发展中的作用,为寻找胃癌潜在的诊断指标和治疗靶点提供了新线索。 方法:采用qRT-PCR检测胃癌细胞株SGC-7901、MGC-803、MKN-28和胃粘膜上皮细胞系GES-1中miR-33b的表达;将过表达miR-33b和 Negative Control分别转染至胃癌细胞株 SGC-7901和MGC-803中,48小时后用荧光显微镜和qRT-PCR观察与检测转染效率;CCK8法、克隆形成实验、划痕实验和 transwell迁移和侵袭实验检测过表达 miR-33b对胃癌细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭的作用;采取qRT-PCR、Western blot和免疫荧光实验分别检测过表达miR-33b后胃癌细胞株中E-cadherin以及Vimentin中mRNA和蛋白的表达。 分别利用TargetScan、PicTar、miRDB及miRanda在线网站预测miR-33b的靶基因,取各个预测结果交集,查询miRecords及文献中经实验验证的靶基因,与预测靶基因取并集作为后续分析的miR-33b靶基因集,在线使用 DAVID对其靶基因集合进行功能富集分析(GO-analysis)和KEGG通路富集分析(KEGG Pathway analysis);选取参与调控 EMT的靶基因 c-myc作为后续研究,采用 qRT-PCR以及 Western blot检测过表达 miR-33b后胃癌细胞中c-myc基因mRNA和蛋白表达水平。 结果:与胃粘膜上皮细胞系 GES-1相比,miR-33b在胃癌细胞株 SGC-7901、MGC-803和 MKN-28中表达量下降(P<0.05);转染过表达miR-33b至胃癌细胞株SGC-7901和MGC-803中,48小时后荧光显微镜观察转染率约为70%, qRT-PCR检测胃癌细胞株SGC-7901和MGC-803转染过表达miR-33b后miR-33b表达水平显著提高(p<0.05);过表达 miR-33b对胃癌细胞株 SGC-7901和MGC-803增殖抑制作用明显(P<0.05);平板克隆集落形成能力下降(p<0.05);划痕实验和Transwell实验证实过表达miR-33b后,胃癌细胞侵袭(p<0.05)和迁移(p<0.05)能力明显下降;qRT-PCR结果显示, miR-33b过表达的胃癌细胞SGC-7901中E-cadherin mRNA表达增强(p<0.05),Vimentin没有显著变化(p>0.05);过表达miR-33b后胃细胞MGC-803中E-cadherin mRNA以及Vimentin mRNA与对照组相比没有统计学意义(p>0.05);免疫荧光结果提示,与对照组相比,过表达miR-33b的SGC-7901和MGC-803细胞E-cadherin蛋白荧光强度增强;Vimentin蛋白与对照组相比减弱;Western blot检测转染过表达miR-33b后胃癌细胞SGC-7901中Vimentin表达降低,E-cadherin表达升高(p<0.05),在 MGC-803细胞中 E-cadherin蛋白表达升高(p<0.05),Vimentin蛋白表达水平没有统计学意义(p>0.05)。 经TargetScan、PicTar、miRDB及 miRanda软件的预测,与miR-33b存在互补结合位点的靶基因分别有534种、160种、199种及2859种,取这些靶基因交集共有31个。利用DAVID对miR-33b的40个靶基因进行 GO分析和 KEGG通路分析,从聚类结果可知miR-33b靶基因主要涉及了蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性调控、ATP连接分子、RNA聚合酶II启动子的转录负调控、以及凋亡程序负调控等分子功能,在KEGG信号通路聚类分析中,结果显示miR-33b靶基因集合主要参与了MAPK信号通路和癌症中 microRNA的调控。qRT-PCR和 Western Blot实验显示过表达 miR-33b后能抑制SGC-7901和MGC-803细胞株中c-myc mRNA和蛋白表达(p<0.05)。 结论: 1. miR-33b在胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803、MKN-28中低表达。 2. miR-33b在体外能抑制胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭与EMT。 3. miR-33b调控靶基因c-myc。