肺动脉高压是严重危害人类身心健康的一种疾病，其发病仅次于高血压和冠心病，在心血管疾病中位居第三位。其特征是肺血管收缩和肺血管改建，并最终导致右心衰竭和死亡。引起肺动脉高压的原因很多，随着社会的发展，以缺氧和呼吸系统疾病所致的肺动脉高压发病率正逐年上升。缺氧引起的肺血管收缩是肺动脉高压和肺心病发生发展的重要环节。肺血管收缩与细胞内钙离子浓度密切相关。Vadula等发现，缺氧可引起肝细胞内线粒体源性活性氧产生增加1，从而使线粒体在HPV中的作用受到特别关注。大量研究已基本证实，HPV的核心机制主要是缺氧诱导线粒体产生活性氧，从而抑制肺血管平滑肌细胞膜上的电压门控性K~+通道，使细胞膜去极化，细胞外钙内流，最终导致细胞收缩2。与缺氧性肺血管收缩反应不同的是，体循环血管在缺氧时表现为舒张，以此增加血流量，保证组织的供血和供氧。有研究表明，缺氧使得肺循环血管K~+通道受抑制，血管收缩，而体循环血管K~+电流增加，血管扩张3。在缺氧刺激下，肺动脉平滑肌能量产生和利用增加，股动脉平滑肌则迅速降低，从而使得肺动脉收缩而股动脉舒张，由此可见，肺、体循环动脉血管平滑肌在缺氧时的变化差异可能与能量有关。线粒体是细胞能量生成和氧化磷酸化的主要场所，不同的组织因为能量需求不同其线粒体也存在差异。其差异不仅仅表现在线粒体数目上4，而且也体现在形态5、结构6,7和功能8等诸多方面，即线粒体存在异质性。肺动脉平滑肌细胞中的线粒体和体循环动脉平滑肌细胞中的线粒体，无论是在功能还是形态上，都有差异，肺动脉平滑肌中的线粒体多呈现梭形或者椭圆形，基础呼吸率较高，而股动脉平滑肌中的线粒体则多为长条形，基础呼吸率较肺动脉平滑肌低9。线粒体源性的活性氧在HPV中发挥关键作用，促使人们越来越重视线粒体异质性在肺、体循环血管对缺氧反应差异中所起的作用，然而，要深入揭示其中的机制和意义有待新的技术路线和研究策略。通过预实验研究发现，离体分离的线粒体在相当程度上能够保持其在体内或者细胞内的功能和特征，而且能够融入到培养的细胞、离体血管以及活体肺循环血管平滑肌细胞中，在此基础之上，本研究将深入探讨线粒体差异对缺氧性肺血管收缩和肺动脉高压的影响，以期望为肺动脉高压机制研究和治疗提供可供探索的全新的途径。第一部分线粒体异质性对血管平滑肌细胞急性缺氧反应的影响目的探讨外源性线粒体向细胞内移植的动力学特征，并在此基础上观察，分别移植同源性和异源性线粒体对PASMC和FASMC缺氧反应的影响。方法用DsRed-mito和GFP-mito标记平滑肌细胞线粒体；利用梯度离心法从细胞中提取带荧光标记的线粒体并孵育细胞；用共聚焦荧光显微镜观察外源性线粒体在细胞被的分布情况，并分析外源性线粒体移植的动力学特征；用EB抑制内源性线粒体DNA合成；用Fura-2/AM探针检测细胞内钙离子变化；用JC-1检测细胞膜电位。结果1.活细胞共聚焦成像技术观察，空白对照组PASMC没有任何荧光显示，而孵育了标记DsRed外源性线粒体的PASMC组，细胞内有红色荧光，表明外源性线粒体进入细胞内。通过二维荧光计数分析可知，外源性线粒体进入细胞的数量具有孵育浓度和时间依赖性。而通过共聚焦三维重构发现，进入细胞的外源性主要分布在靠近细胞膜的区域内。2.对照组肺动脉平滑肌细胞缺氧时，胞浆内钙离子浓度增加，与添加Py+Ur(提供细胞所需的能量)的细胞反应一致；而添加Py+Ur+EB (EB耗竭细胞内线粒体DNA合成，同时Py和Ur为细胞提供能量)的细胞缺氧时，胞浆内钙离子浓度没有变化；移植入PASMC-mito可逆转线粒体DNA剔除的PASMC胞浆内钙反应消失；而移植入FASMC-mito却无此作用。缺氧诱导FASMC胞浆内钙离子浓度降低，添加Py+Ur不影响股动脉平滑肌细胞缺氧时钙离子降低；线粒体DNA剔除则使细胞在缺氧时不引起细胞胞浆内钙离子浓度降低，移植PASMC-mito后使线粒体DNA剔除的细胞在缺氧时产生明显的细胞内钙离子浓度升高；而移植FASMC-mito可恢复缺氧引起的细胞内钙离子浓度下降这一反应。PASMC和FASMC在不剔除自身内源性线粒体的条件下直接转入外源性线粒体，其对缺氧引起的钙反应的影响类似于以上实验结果。3.移植了PASMC-mito的肺动脉平滑肌细胞在缺氧时，细胞膜去极化，反应与正常肺动脉平滑肌细胞一样，然而移植了FASMC-mito后细胞膜出现超极化。移植同源性细胞线粒体的FASMC在缺氧时，和正常股动脉平滑肌细胞一样，细胞膜均超极化；而移植来自异种细胞线粒体(PASMC-mito)后，缺氧会引起细胞膜稳定去极化。结论1.外源性线粒体移植入细胞的数量具有时间和浓度依赖性，并且空间分布主要位于靠近细胞膜一侧。2.移植FASMC-mito可以使肺动脉平滑肌细胞内钙离子浓度在缺氧时降低，而移植PASMC-mito可使股动脉平滑肌细胞内钙离子浓度在缺氧时升高。3.移植FASMC-mito可以使肺动脉平滑肌细胞膜电位在缺氧时降低，而移植PASMC-mito则使股动脉平滑肌细胞膜电位在缺氧时升高。第二部分线粒体异质性对缺氧性肺血管收缩和肺动脉高压的影响目的探讨外源性同源、异源线粒体移植对离体血管环急性缺氧反应以及载体肺动脉高压的影响方法梯度离心法分离细胞内线粒体，并孵育离体血管环，通过张力实验检测血管环收缩功能；通过尾静脉注射的方式将外源性线粒体移植到大鼠体内；用常压低氧法建立大鼠慢性缺氧模型，并利用四导仪分别检测模型大鼠的肺动脉压和体循环压；通过组织石蜡切块HE染色观察肺血管重构和肌化程度。结果1.去除内皮的PA缺氧时收缩；移植PASMC-mito的PA缺氧时收缩程度比对照组略有增加，但无统计学意义；移植FASMC-mito的PA，在缺氧时并无收缩反应。内皮完整的PA缺氧1小时，PA呈现经典的两相收缩反应；移植PASMC-mito后，对缺氧反应无明显影响；移植FASMC-mito的PA，缺氧时的两相收缩反应均有不同程度的抑制。2.去除内皮的FA缺氧时舒张；移植FASMC-mito对FA缺氧引起的舒张无显著影响；但是移植PASMC-mito后，FA对缺氧产生收缩反应。内皮完整的FA缺氧1小时，FA持续舒张，直至到达基线张力水平；移植FASMC-mito后，缺氧时FA的反应与对照组一致；但是移植PASMC-mito后，缺氧引起FA呈现经典两相收缩反应。3.空白对照组大鼠缺氧10分钟，肺动脉压和体循环压分别出现典型的升高和降低；尾静脉注射PASMC-mito的实验组大鼠，与对照组相比，其缺氧时肺动脉压略有升高；而尾静脉注射FASMC-mito可降低缺氧引起的肺动脉压升高。此外，无论是PASMC-mito还是FASMC-mito注射，对大鼠体循环压没有任何影响。为了排除心输出量的影响，同时计算了血管阻力值，得出的结论与肺动脉压结果一致，即移植PASMC-mito，大鼠肺血管阻力略有增加；移植FASMC-mito可显著降低缺氧引起的大鼠肺血管阻力升高。同样，外源性线粒体移植对体循环阻力没有任何影响。4.正常环境下饲养的对照组大鼠，无论是尾静脉注射PBS还是外源性线粒体，其Ppa、PVR和RV/(LV+S)都没有变化；而慢性缺氧模型组，缺氧模型建立后无论是尾静脉注射PBS还是外源性线粒体，与各自对照组相比，Ppa、PVR和RV/(LV+S)均明显升高；其中，尾静脉注射FASMC-mito组，相对于CH+PBS (CH表示慢性缺氧)组和CH+PASMC-mito组，以上三个指标均有所下降。而体循环动脉压没有因为外源性线粒体的移植而发生任何变化；尾静脉注射了FASMC-mito后，大鼠的肺动脉肌化程度也明显减弱或者消失。在慢性缺氧过程中给予外源性线粒体尾静脉注射，得出的结论同上述结果一致。结论1.移植FASMC-mito使PA缺氧时收缩程度降低，移植PASMC-mito使FA缺氧反应由舒张变为收缩。2.静脉注射FASMC-mito能够降低缺氧引起的肺动脉高压，静脉注射PASMC-mito对肺动脉高压没有影响，两种外源性线粒体对体循环压没有任何影响。3.尾静脉注射FASMC-mito能改善慢性缺氧性肺动脉高压的形成，减轻肺血管阻力、肌化和重构。