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[目 的]通过以人牙周膜干细胞(Human periodonta 1 ligament stem cells,hPDLSCs)作为研究对象,分析其免疫调节特性,探讨小分子干扰RNA(siFasL)对hPDLSCs的免疫调节作用,并探究FasL的低表达是否对hPDLSCs的增殖凋亡及成骨情况产生影响,为研究牙周炎的病理机制及临床的有效治疗提供理论依据。[方 法](1)本研究采用酶解组织块法获得原代hPDLSCs,有限稀释法克隆化对其进行分离纯化。通过克隆形成实验以及流式细胞术检测hPDLSCs的增殖状态;利用免疫荧光检测间充质干细胞表面表达的CD146和STRO-1;流式细胞术对间充质干细胞表面标记物(CD90、CD105、CD44)进行测定以表征其是否高表达,以及是否低表达造血干细胞表面标记物(CD45、CD34):在体外分别对hPDLSCs进行成骨诱导,以及成脂肪诱导来检测其是否具有多向分化的能力。(2)将人外周血中的单个核细胞(Human Peripheral blood mononuclearcells,PBMCs)置于上层,hPDLSCs细胞置于下层,两种细胞通过Transwell小室建立共培养体系,然后将实验分为非共培养组及共培养组,通过qRT-PCR、Elisa及Western blot三种检测手段分别检测非共培养组与共培养组中,hPDLSCs中免疫调节因子(TGF-β、IDO、IL-10)及 PBMCs 中炎症因子(TNF-Ｐ、IFN-γ、IL-1α)的mRNA及蛋白的表达,探究hPDLSCs自身的免疫调节性能。(3)构建siFasL的转染体系,转染hPDLSCs,分为空白对照组,转染无关序列组与转染siFasL组,然后与PBMCs共培养,通过qRT-PCR、Western blot和Elisa三种方法分别检测各组中hPDLSCs免疫调节因子(TGF-β、IDO、IL-10)mRNA和蛋白的表达情况,以及PBMCs中炎性因子(TNF-α、IFN-γ、IL-1α)mRNA及蛋白的表达,探究共培养体系中FasL对hPDLSCs的免疫调节作用。其次,通过流式细胞仪检测转染无关序列及转染siFasL后各组hPDLSCs的细胞周期及细胞所处的活性状态,探讨siFasL是否影响hPDLSCs的增殖与凋亡,qRT-PCR、Western blot检测各组中成骨相关基因Runx2及ALP的表达,以及体外进行成骨诱导后茜素红和及ALP染色,探究siFasL对hPDLSCs成骨特性的影响。[结 果](1)酶解组织块法与有限稀释法克隆化培养结合得到镜下观察形态为长梭形或者不规则形呈放射状或者旋涡状排列的hPDLSCs;hPDLSCs增殖能力的检测实验:克隆形成实验以及细胞周期的检测都显示其增殖能力较强;通过免疫荧光分析实验所获得的hPDLSCs能阳性表达间充质干细胞表面标记物STRO-1、CD146;所获得的hPDLSCs通过流式细胞术分析得到其间充质干细胞表面标记物CD90、CD105、CD44表达量较高,造血干细胞表面标记物CD34、CD45表达量较低。对所获得的hPDLSCs进行体外成骨诱导后用茜素红染色,结果为(+);同时对所获得的hPDLSCs进行体外成脂肪诱导,结果显示肉眼可观察到油红O染色也为(+),镜下可见细胞胞浆中体积较大的圆形脂滴形成。(2)通过Transwell小室将hPDLSCs与PBMCs共同培养,使用qRT-PCR技术对下层细胞hPDLSCs中免疫调节因子(TGF-β、IDO、IL-10)及上层细胞PBMCs中炎性因子(TNF-Ｐ、IFN-y、IL-1α)的mRNA的变化水平进行检测,Elisa分别检测两种细胞中各自的细胞培养上清液里面上述细胞因子的蛋白浓度的变化水平。以上实验结果均显示共培养组与非共培养组相比,共培养组hPDLSCs的免疫调节因子的mRNA及蛋白的表达量均显著升高(P<0.01),PBMCs中炎性因子mRNA量及蛋白的表达量均降低(P<0.01)。(3)实验设计为:空白对照序列,无干扰对照序列,以及siFasL101,siFasL102,siFasL103五组,各组的序列分别被转染到hPDLSCs中,在接受转染2天后,通过实时PCR对转染后hPDLSCs上FasL的mRNA表达量进行测定,结果显示空白对照组与无关序列对照组的表达量之间不存在差异(P>0.05),故转染试剂lipo2000对本实验所产生的干扰可以忽略,转染siFasL101,siFasL102,siFasL103三组中hPDLSCs中FasL的mRNA表达量均明显降低,差异有统计学意义(P<0.01),并筛选出沉默最佳序列siFasL102。转染6h后,将转染无关序列组、接受siFasL有效转染后的hPDLSCs组分别与经过刀豆蛋白(Concanavalin A,ConA)活化的PBMCs共同进行培养,在共同培养2天后,利用qRT-PCR、Western blot和Elisa对各实验分组中hPDLSCs的免疫调节因子(TGF-β、IDO、IL-10)的mRNA及蛋白的表达水平变化进行测定,发现转染siFasL有效序列与转染无关序列组相比,免疫调节因子的表达均显著降低(P<0.01或P<0.05);4.共培养48h后,通过流式细胞术分别检测转染无关序列及转染siFasL有效序列两组中hPDLSCs的增殖及凋亡,发现转染siFasL有效序列与转染无关序列组相比,增殖指数升高,凋亡率降低(P<0.01)。5.共培养48h后通过茜素红染色、ALP染色以及qRT-PCR检测两组中ALP、Runx2的mRNA表达,Western blot检测Runx2的表达,发现转染siFasL有效序列与转染无关序列组相比,成骨相关因子的表达显著降低(P<0.01 或 P<0.05)。[结 论](1)本研究中将酶解法与有限稀释法多克隆化培养进行联合运用,获得了 hPDLSCs,经鉴定属于牙源性来源的其中一种间充质干细胞,所以具备较强的增殖能力及成骨、成脂肪的分化的潜能。(2)HPDLSCs具有调节免疫的能力,主要是通过分泌一些可溶性的免疫调节因子的方式进行免疫调节,发挥免疫调控作用。(3)siFasL可以影响hPDLSCs免疫调节能力,其主要是通过抑制hPDLSCs分泌可溶性免疫调节因子来进行调控。(4)siFasL参与调控hPDLSCs的增殖与凋亡,能促进hPDLSCs增殖并抑制其凋亡。(5)siFasL参与调控hPDLSCs的成骨分化,低水平表达的FasL能降低hPDLSCs的成骨分化能力。