脑是一个对缺氧最敏感的器官，它的活动丰要依靠葡萄糖有氧氧化提供能量，因此一旦缺血时间较长即可引起严重的不可逆性损伤。脑缺血一定时间后恢复血液供应，其功能不但未能恢复，而且出现了更加严重的脑机能障碍，称之为脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injurv，CIRI)。CIRI的机理十分复杂，有多种因素参与其中。目前研究表明，CIRI与自由基的生成、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸毒性、白细胞高度聚集和高能磷酸化合物的缺乏等冈素有关。CIRI引起的脑部疾病不仅严重影响患者的生活质量，而且还给家庭和社会带来巨大的经济负担。目前临床上尚无有效的治疗药物，因此研究CIRI的机制，开发治疗，CIRI药物是目前人们研究的热点之一。 研究发现，咪唑安定能通过降低脑氧代谢率、降低颅内压、减少谷氨酸摄入、激活γ-氨基丁酸(GABA)A受体等作用产生脑保护。既然咪唑安定对脑有保护作用，那么对CIRI是否同样存在保护作用昵?目前，国内关于咪唑安定对大鼠CIRI的脑保护作用及其作用机制的研究尚处于起步阶段。我们的实验利用行为学检查、病理学技术、脑组织生化指标检测及高效液棚色谱法旨在明确咪唑安定对大鼠CIRI是否有治疗作用及其作用机制，为临床用药起到指导作用。 本实验利用血管内线栓法制作大鼠单侧大脑中动脉栓 塞(middle cerebral artery occlusio，MCAO)模型，观察咪唑安定对大鼠CIRI的治疗作用，并对其作用机制进行研究。实验内容如下： 一、咪唑安定对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用 目的：通过对大鼠CIRI神经功能评估、脑梗塞体积测定、海马神经元损伤状况测定，研究咪唑安定对大鼠CIRI的脑保护作用。 方法：参考Longa等的方法制备大鼠CIRI模型。选用60只250～350g健康雄性SD大鼠，随机分为3组：(1)假手术组；(2)模型对照组；(3)咪唑安定组。假手术组的手术操作和其他组相同，只分离血管但不阻断。模型对照组：大鼠脑缺血再灌注前30min，脑缺血再灌注10min和60min，分别腹腔注射生理盐水10ml/kg。咪唑安定组：大鼠脑缺向．再灌注前30min，脑缺血再灌注10min和60min，分别腹腔注射咪唑安定10mg/kg。 1、神经功能缺陷评估，按Zea longa评分标准，大鼠经过24h的脑再灌注后，行神经功能缺陷的检查，按缺陷严重程度评级评分。2、脑组织标本制备，用于HE染色。大鼠断头取脑，4％多聚甲醛固定，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察海马神经元损伤状况，高倍镜下计数海马CA1区的、正常锥体细胞数。 3、脑梗塞体积测定，TTC染色，数码相机摄片，计算机图像分析，得出脑梗死体积。 结果：1、CIRI大鼠经过24h的脑再灌注后，行神经功能缺陷的检查，缺陷程度较严重，多数分布于0级，1级，2级，3级。按Zea longa评分标准，模型对照组和咪唑安定组大鼠评分明显高于假手术组(P<0.05)。咪唑安定组大鼠与模型对照组相比，评分明显降低(P<0.05)，说明咪唑安定对CIRI大鼠神经功能有保护作用。 2、HE染色结果 光镜下观察病理切片，假手术组大鼠海马结构正常，有3～4层锥体细胞，排列整齐紧密，细胞胞质丰富，核圆形、无同缩或溶解，核仁清晰可见；模型对照组大鼠海马失去正常结构，锥体细胞大量变性，正常神经元数目较假手术组明显减少(P<0.05)；咪唑安定组CA1区正常锥体细胞数较模型对照组明显增多(P<0.05)，镜下坏死细胞则明显减少，说明海马损伤效应得到明显缓解。 3、TTC染色结果假手术组大脑组织呈深红色，模型对照组和咪唑安定组均有白色梗塞区域。对大脑海马形态的影响，按脑梗死体积大小排列为：模型对照组>咪唑安定组>假手术组，差异有统计学意义(P<0.05)。 结论：咪唑安定对CIRI大鼠有一定的脑保护作用，能保护CIRI大鼠神经功能，减少海马神经元损伤，减少脑梗死体积。 二、咪唑安定对大鼠脑缺血再灌注损伤保护作用机制研究 目的：通过对CIRI大鼠细胞凋亡检测、脑组织匀浆中SOD，MD八含量的测定及脑组织GABA含量的测定，研究咪唑安定对大鼠CIRI的脑保护作用机制。 方法：参考Longa等的方法制备大鼠CIRI模型。选用80只250～350g健康雄性SD大鼠，随机分为4组：(1)假手术组；(2)模型对照组；(3)咪唑安定组；(4)咪唑安定联合氟马西尼组。假手术组的手术操作和其他组相同，只分离血管但不阻断。模型对照组：大鼠脑缺血再灌注前30min，脑缺血再灌注10min和60min，分别腹腔注射生理盐水10ml/kg。咪唑安定组：大鼠脑缺血再灌注前30min，脑缺血再灌注10min和60min，分别腹腔注射咪唑安定10mg/kg。咪唑安定联合氟马西尼组:大鼠脑缺血再灌注前30min，脑缺血再灌注10min和60min，分别同时腹腔注射咪唑安定10mg/kg和氟马西尼1mg/kg。1、TUNFL法检测细胞凋亡，在光镜400倍视野下随机选取5个视野，分别计数阳性细胞(镜下核染色呈棕黄色者)数和阴性细胞数并取其平均值，计算凋亡细胞百分率[凋亡细胞百分率=阳性细胞数/(阳性细胞数+阴性细胞数)×100％]。2、脑组织匀浆中生化指标的测定，按试剂盒操作说明测定脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量。3、高效液相色谱法测定大鼠脑组织GABA含量。 结果：1、TUNEL法检测细胞凋亡，咪唑安定组凋亡细胞较模型对照组明显降低(P<0.05)；咪唑安定联合氟马西尼组与模型对照组相比无明显差别(P>0.05)。2、对脑组织中生化指标的影响，缺血再灌注组SOD活性与假手术组相比无明显筹别(P>0.05)，而脑组织MDA含量最著增加(P<0.05)。咪唑安定组脑组织MDA含量与缺血再灌注组相比明显下降(P<0.05)。3、高效液相色谱法测定大鼠脑组织GABA含量，咪唑安定组的GABA含量明显小于模型对照组(P<0.05)；咪唑安定联合氟马西尼组的GABA含量与模型对照组相似，无统计学差异(P>0.05)。 结论：咪唑安定对大鼠CIRI有保护作用，其作用机制是咪唑安定与中枢神经系统的GABA<,A>受体的Bz调节点结合，引起GABA<,A>受体构象改变，增强受体与GABA的亲和力及增加氯通道的开放频率，使氯离子进入细胞内，形成神经细胞膜的超极化状态，抑制中枢神经系统的兴奋性，对CIRI大鼠起到保护作用。