论文部分内容阅读
背景:急性肾脏缺血再灌注(Ischemia reperfusion,IR)损伤是肾移植等外科术后常见的并发症。一旦发生,严重影响患者的预后。目前尚缺乏特效药物,临床上主要通过肾脏替代疗法(包括血液透析和腹膜透析)暂时替代患者的肾脏功能,被动地等待其肾脏功能的自我恢复。如果能够找到治疗急性肾脏IR损伤的有效药物,将会具有很好的临床应用前景。虎杖苷(Polydatin,PD)是一种具有多种药理学活性的天然抗氧化剂,其在多种缺血性损伤器官中显示出良好的保护作用。尽管部分研究显示PD在肾脏IR损伤中具有明显的保护效果,但其在IR损伤肾脏的具体作用机制仍然有待进一步探讨。目的:本研究拟通过建立肾脏IR损伤的小鼠模型和体外培养细胞模型,对PD在IR损伤肾脏的保护作用进行评价,并探讨其潜在的分子机制。通过检测小鼠的血肌酐(Scr)和尿素氮(BUN),评价PD在改善模型小鼠肾脏功能方面的作用;通过对肾脏组织进行病理学评分(HSK)和凋亡染色(TUNEL),评价PD在降低模型小鼠肾脏组织损伤程度方面的作用;通过测定氧化应激指标和炎症相关分子,评价PD在IR损伤肾脏的抗氧化应激和抗炎效果;通过应用特异性抑制剂渥曼青霉素(Wortmannin,Wort)阻断磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路,以及在体外细胞实验中加入人音猬(sonichedgehog,shh)因子重组蛋白来激活shh信号通路,进一步探讨pd在肾脏ir损伤中发挥肾脏保护作用的潜在分子机制。方法:实验一,20~25g的雄性balb/c小鼠,随机分为5组:(1)假手术组;(2)ir组;(3)pd低剂量(10mg/kg)组;(4)pd中剂量(20mg/kg)组;(5)pd高剂量(40mg/kg)组。通过夹闭双侧肾蒂阻断肾脏血供30min,然后恢复血供的方法,建立肾脏ir损伤小鼠模型。假手术组仅开腹,游离但不夹闭肾蒂。术后第3天取小鼠的血液和肾脏。通过检测血清中scr和bun的水平,对肾脏标本进行hsk评分和tunel凋亡染色,评价小鼠的肾功能和肾组织损伤程度。比色法检测肾组织中氧化应激指标丙二醛(mda)、一氧化氮(no)的含量和超氧化物歧化酶(sod)的活力。westernblot检测肾组织中环氧化物合成酶-2(cox-2)、诱导型一氧化氮合成酶(inos)的表达和akt的磷酸化水平。elisa法检测小鼠肾组织中的肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、白细胞介素-1β(il-1β)、前列腺素e-2(pge-2)的含量。实验二,20~25g的雄性balb/c小鼠,随机分为6组:(1)假手术组;(2)假手术给予wort干预组;(3)肾脏ir损伤模型组;(4)模型给予wort干预组;(5)pd(40mg/kg)干预组;(6)pd(40mg/kg)干预合并给予wort干预组。在本部分实验中,给予小鼠腹腔内注射pi3k/akt通路抑制剂wort(1mg/kg)用于阻断其体内akt的活化。术后第3天取小鼠的血液和肾脏。通过检测scr和bun,对肾脏标本进行hsk评分和tunel凋亡染色,评价小鼠的肾功能和肾组织损伤程度。比色法检测肾组织中氧化应激指标mda、no的含量和sod的活力。westernblot法检测肾组织中cox-2、inos的表达和akt的磷酸化水平。elisa法检测小鼠肾组织中tnf-α、il-1β和pge-2的含量。实验三,在常氧或氧-糖剥夺/复氧(ogd/r)条件下培养人类近端肾小管上皮细胞系(hk-2),并给予相应的药物干预(包括pd、wort和shh蛋白)。mtt法评价hk-2细胞的存活能力。elisa法检测tnf-α和il-1β在培养细胞的上清液中的含量。westernbolt法检测细胞中akt蛋白的磷酸化水平和shh蛋白的表达水平。结果:实验一,与模型组相比,高剂量pd显著降低了肾脏ir损伤小鼠的scr和bun,显著降低了ir损伤肾脏的hsk和tunel阳性细胞率,显著降低了ir损伤肾脏中mda的含量,并明显上调了ir损伤肾脏中sod的活性(p<0.05)。在肾脏ir损伤小鼠模型的肾脏组织,高剂量的pd显著上调了akt的磷酸化水平,显著抑制了COX-2和iNOS的表达,并显著减少了COX-2和iNOS的下游产物分子PGE-2和NO的产生(P<0.05)。ELISA结果显示,与假手术组相比,TNF-α和IL-1β在IR损伤肾脏中的表达明显升高(P<0.05);与模型组相比,20和40 mg/kg的PD均显著地抑制了TNF-α和IL-1β在IR损伤肾脏组织中的表达(P<0.05)。实验二,Western blot显示,腹腔注射1 mg/kg的Wort可显著抑制模型小鼠肾脏中Akt的磷酸化(P<0.05)。与单用PD处理而不加Wort组相比较,PD联合Wort干预明显增加了肾脏IR损伤小鼠的BUN和Scr,明显增加了其肾脏的HSK和TUNEL阳性细胞百分数,并明显削弱了PD的抗氧化应激(包括减少MDA含量和增加SOD活性)和抗炎(包括抑制TNF-α、IL-1β、COX-2和iNOS的表达和降低PGE-2和NO的含量)效果(P<0.05)。实验三,PD明显改善OGD/R模型细胞的存活,并显著抑制OGD/R诱导上调的细胞对TNF-α和IL-1β的分泌;抑制PI3K/Akt信号通路的激活可削弱PD的促细胞存活和抗炎作用;PD上调Shh蛋白在OGD/R细胞的表达,抑制PI3K/Akt通路激活会导致PD上调Shh蛋白表达的效果被降低;外源给予Shh蛋白促进了OGD/R细胞的存活,并显著降低细胞的炎性反应(P<0.05)。结论:PD可改善肾脏IR损伤小鼠的肾功能,降低IR导致的肾组织病理学损伤,并在IR损伤肾脏发挥抗凋亡、抗氧化应激和抗炎的有益作用,其机制可能是通过激活PI3K/Akt信号通路实现的。同时我们还初步证明了PD可通过上调Shh蛋白的表达在OGD/R肾小管上皮细胞发挥促存活和抗炎作用,其机制可能部分依赖于PI3K/Akt信号通路的激活。