论文部分内容阅读
[目的]本研究采用脐带间充质干细胞(Umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSC)治疗自发性狼疮性肾炎MRL/lpr小鼠,初步探究UC-MSC治疗狼疮性肾炎(lupus nephritis,LN)的作用及相关机制,希望为UC-MSC的应用提供一定的理论依据。[方法]1.UC-MSC的分离、鉴定及致瘤性研究1.1原代分离脐带来源的MSC,并进行形态学观察。1.2采用流式细胞术对分离的MSC进行表型鉴定。1.3阿利新蓝染色、油红O脂肪染色、茜红素染色鉴定UC-MSC分化为软骨细胞、脂肪细胞以及成骨细胞的能力。1.4使用BALB/c小鼠用皮下成瘤实验验证UC-MSC是否具有致瘤性。2.UC-MSC治疗MRL/lpr小鼠的作用及机制2.1选取自发狼疮性肾炎的3周龄MRL/lpr小鼠24只,饲养至第10周分4组,每组6只。①LN模型组,给予尾静脉生理盐水治疗。②MP组,于14周给与尾静脉注射1.33 mg/kg的甲泼尼龙琥珀酸钠针,连续治疗3天。③UC-MSC组,在10周、12周、14周给予尾静脉注射2×105个UC-MSC治疗,共3次。④UC-MSC+MP组,在10周、12周、14周给予尾静脉2×105个UC-MSC治疗的基础上于14周给与尾静脉1.33mg/kg的甲泼尼龙琥珀酸钠针治疗。于16周处死小鼠,收集血液及肾脏标本。2.2检测各组小鼠血清血尿素氮、血肌酐,判断小鼠肾脏功能,并采用ELISA法检测各组小鼠血清ds-DNA水平,明确自身抗体情况。2.3各组小鼠肾组织石蜡切片进行HE、PAS及Masson染色观察肾组织病理损伤情况。戊二醛固定的小鼠肾组织送检电镜,观察肾组织超微结构。2.4各组小鼠肾组织石蜡切片进行CD3、CD68免疫组化染色,明确肾组织浸润的细胞种类、区域并进行半定量分析。2.5各组小鼠肾组织冰冻切片进行免疫荧光Podocin染色,观察肾小球足细胞特异性蛋白Podocin的表达变化。2.6采用ELISA法检测各组小鼠血清IFN-γ、TNF-α、TGF-β1水平。2.7采用Western bloting法检测各组小鼠肾组织TGF-β1、p-Smad3、TRAF6蛋白表达情况。3.UC-MSC对TGF-β1刺激下大鼠肾小球足细胞的保护作用3.1体外实验采用采用不同浓度TGF-β1(2 ng/ml、4 ng/ml、8 ng/ml)刺激大鼠肾小球足细胞,CCK8法检测不同浓度的TGF-β1刺激下对大鼠肾小球足细胞活力的影响。3.2体外实验采用CCK8法检测在8 ng/ml的TGF-β1刺激下,大鼠肾小球足细胞活力的变化,以及UC-MSC干预能否改变TGF-β1对足细胞活力的影响。3.3采用Western Bloting法检测在8 ng/ml的TGF-β1刺激下,大鼠肾小球足细胞Synaptopodin表达的变化,以及UC-MSC干预能否改变TGF-β1对足细胞Synaptopodin表达的影响。4.统计学方法使用SPSS 22.0软件进行统计分析。测量数据以均数±标准差的方式表示,采用非配对T检验及单因素方差分析(One Way Anova)比较差异。P<0.05认为具有统计学意义。[结果]1.培养的UC-MSC的细胞形态呈长梭形,流式细胞术检测结果提示:免疫表型CD90、CD105、CD73 均为阳性,CD45、CD34、CD19、CD11b 和 HLA-DR为阴性表达,可分化为软骨细胞、脂肪细胞、成骨细胞,符合2006年国际细胞治疗协会MSC的鉴定标准。2.正常组小鼠与LN模型组小鼠相比,血清ds-DNA、血尿素氮、血肌酐明显升高(p<0.001,p<0.05,p<0.01);肾组织石蜡切片 HE、PAS、Masson 染色可见,LN模型组与正常组小鼠相比,肾小球体积增大,肾小球系膜区系膜基质重度增生,并伴随肾组织纤维化,肾间质有较多炎性细胞浸润;电镜结果显示LN模型组小鼠肾组织明显有足突融合、毛细血管受压、管腔狭窄、内皮细胞肿胀、基底膜增厚的情况。以上结果提示LN小鼠建模成功。3.与LN模型组相比,MP、UC-MSC以及UC-MSC+MP组血尿素氮均明显下降,具有统计学差异(p<0.05,p<0.01,p<0.05);血肌酐水平仅UC-MSC组明显下降,具有统计学差异(p<0.01),MP组及UC-MSC+MP组仅有下降趋势,但无统计学差异;三组治疗组小鼠与模型组比较,ds-DNA均有下降趋势,但无明显统计学差异。提示UC-MSC治疗可改善MRL/lpr小鼠血肌酐及尿素氮水平,具有肾脏保护作用。4.石蜡切片HE、PAS、Masson染色显示,与LN模型组相比,MP组、UC-MSC组以及UC-MSC+MP组,肾小球系膜区系膜基质增多、肾组织纤维化及肾间质炎性细胞浸润情况均有不同程度的改善。电镜结果显示,与LN模型组相比,MP组、UC-MSC组以及UC-MSC+MP组肾脏足突融合、毛细血管受压、管腔狭窄、内皮细胞肿胀、基底膜增厚的情况均有不同程度改善。提示MP、UC-MSC以及UC-MSC+MP治疗后均能改善LN小鼠的肾脏病理损伤。5.肾组织足细胞Podocin的免疫荧光染色结果显示,LN模型组小鼠肾脏Podocin的表达量与正常组小鼠相比明显减弱,而MP组、UC-MSC组以及UC-MSC+MP组Podocin荧光强度均有不同程度的恢复。提示MP、UC-MSC以及UC-MSC+MP治疗均具有足细胞保护作用。6.肾组织CD3、CD68免疫组化染色显示与正常组相比,LN模型组小鼠肾组织有较多的CD3+T淋巴细胞、CD68+单核细胞胞浸润(p<0.001,p<0.001),与LN模型组相比,MP组、UC-MSC组以及UC-MSC+MP组CD3+T细胞(p<0.01,p<0.01,p<0.01)及 CD68+单核细胞(p<0.001,p<0.001,p<0.001)浸润情况均有不同程度改善。表明UC-MSC治疗能有效减少肾脏CD3+T细胞、CD68+单核细胞的浸润。7.与正常组小鼠相比,LN模型组小鼠血清TNF-α、IFN-γ、TGF-β1水平明显升高(p<0.0,p<0.05,p<0.001),UC-MSC治疗后小鼠血清TGF-β1水平明显下降(p<0.001),但IFN-γ、TNF-α水平仅有下降趋势,无统计学差异。提示UC-MSC治疗能降低MRL/lpr小鼠血清TGF-β1水平。8.Western Bloting结果显示,与正常组相比,LN模型组小鼠肾组织TGF-β1、TRAF6及 p-Smad3 蛋白表达量明显增多(p<0.01,p<0.001,p<0.05)。与LN模型组相比UC-MSC组以及UC-MSC+MP组肾组织TGF-β1(p<0.05,P<0.05)和 TRAF6(p<0.05,p<0.01)蛋白表达量明显下降,UC-MSC+MP组p-Smad3表达量明显下降(p<0.05)。表明UC-MSC可能是通过TGF-β1信号通路改善MRL/lpr小鼠的肾脏损伤。9.体外实验中,在8 ng/ml的TGF-β1刺激48小时后,大鼠肾小球足细胞活力明显受到抑制,Synaptopodin表达水平明显下降,具有统计学差异(p<0.001,p<0.05)。在UC-MSC与大鼠肾小球足细胞(1:10)transwell共培养干预下,足细胞活力无改善,但足细胞特异蛋白Synaptododin的表达水平明显恢复(p<0.001)。在UC-MSC与大鼠肾小球足细胞(1:5)transwell共培养干预下,大鼠肾小球足细胞活力明显改善(p<0.05),Synaptododin的表达水平明显恢复(p<0.001)。提示在TGF-β1刺激下,UC-MSC干预对足细胞损伤具有保护作用。[结论]1.UC-MSC治疗可显著改善MRL/lpr小鼠的肾功能及肾组织病理损伤,并减少MRL/lpr小鼠肾组织CD3+T细胞及CD68+单核细胞的浸润。2.UC-MSC可能是通过TGF-β1信号通路改善MRL/lpr小鼠的肾组织损伤。3.UC-MSC在体内外实验中均具有肾小球足细胞保护作用。