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高粱茎点霉(Phoma sorghina(Sacc.)Boerema,Dorenbosch et Kesteren)是从世界恶性杂草紫茎泽兰(Eupatorium adenophorum Spreng.)的发病叶片上分离得到的病真原菌,其致病的主要原因是高粱茎点霉毒素的作用。本文通过发酵积累高梁茎点霉粗毒素,以生物活性测定为导向,对高粱茎点霉粗毒素进行了分离、纯化并鉴定了毒素的化学结构,对致病效果好的毒素进行了致病范围的测定及致病机制的研究。主要研究结果如下:
1.以紫茎泽兰叶片为生物测定材料,对比离体叶片针刺法和叶圆片法的生测效果,最后选用离体叶片针刺法作为该毒素生物测定的方法,为该毒素的进一步研究提供了可靠的生物检测手段。
2.通过分析高粱茎点霉毒素的热稳定性和酸碱稳定性,表明高粱茎点霉无菌滤液在处理温度低于100℃和pH值为3.0-10.0的条件下,致病性不受影响。以石油醚、四氯化碳、氯仿、乙酸乙酯等4种极性不同的溶剂对高粱茎点霉培养滤液和菌丝进行萃取,获得粗毒素,通过生物活性测定表明,高粱茎点霉菌产生的毒素主要分泌在培养滤液中,属于胞外毒素,乙酸乙酯的萃取效果最好。
3.高粱茎点霉发酵液约120L,用乙酸乙酯萃取后浓缩,积累粗毒素约11g。采用多次硅胶柱层析将11g高粱茎点霉粗毒素进行分离纯化,得到两种对紫茎泽兰叶片有致病活性的毒素物质纯品,分别为毒素A和毒素B;通过GC-MS、NMR及文献数据对比等方法推测了两毒素可能的化学结构,并分别与对照品2-甲基-1,4-苯二酚和3.羟基在苯甲醇经不同TLC展开系统和相同的GC-MS分离检测条件进行比较,结果证明毒素A为2.甲基-1,4-苯二酚(2-Methyl-1,4-Benzenediol),毒素B为3-羟基苯甲醇(3-Hydroxybenzyl alcohol)。分别将两种毒素配制成不同浓度的水溶液进行活性致病测定,结果表明,毒素2-甲基-1,4-苯二酚的活性较强,并以该毒素作为下一步研究工作的重点。
4.采用离体叶片针刺法,对毒素2-甲基-1,4-苯二酚的致病范围进行了测定。结果显示,在所选择的30种植物中,紫茎泽兰、蒲公英、小飞蓬、鬼针草、小藜、龙葵、芹菜、油菜等8种植物对其有较高的敏感性,其他植物也都可以产生较小的病斑,这表明2-甲基-1,4-苯二酚的致病范围较广。
5.研究了毒素2-甲基-1,4-苯二酚对紫茎泽兰叶片丙二醛(MDA)含量以及抗坏血酸过氧化物酶(APX)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)活性的影响。结果表明,毒素能够使紫茎泽兰叶片膜脂过氧化加剧,MDA含量上升,且使APX、PPO、POD等酶的活性受到影响,从而使紫茎泽兰叶片出现受害症状。