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近年来,在糖尿病足的治疗方面有了很多的进展,但仍有一部分患者因为病程较长血管损伤严重,动脉远端无流出道,使得临床治疗非常棘手,难以取得令人满意的疗效,最终导致截肢甚至危及患者的生命。因此,临床上迫切需要寻找一种创伤小、患者容易接受且疗效好的新的治疗方法。干细胞移植技术的出现为糖尿病足的治疗带来了新的前景,近年来已成为国内外学者研究的热点之一。然而,临床上干细胞移植治疗糖尿病足受患者机体代谢状态、血糖水平、氧化应激及内毒素等微环境因素影响,临床疗效也相应发生改变。因此,本研究通过观察脂多糖(LPS)对外周血单个细胞(PBMCs)向血管内皮细胞(VECs)分化过程的影响,为临床干细胞治疗糖尿病足的最佳时机奠定理论基础。 目的:观察不同浓度LPS对外周血单个核细胞体外向血管内皮细胞分化能力的影响。 方法:无菌条件下取健康成人外周血20ml,肝素抗凝,应用密度梯度离心法分离成人外周血单核细胞,向DMEM-F12培养基中分别加入体积分数20%的胎牛血清、血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),对PBMNCs进行诱导培养48h后,收集贴壁细胞培养后加入不同浓度 LPS(0.00μ g/mL、0.01μ g/mL、0.10μ g/mL、1.00μ g/mL、10.00μ g/mL)并干预72h,运用流式细胞仪检测内皮祖细胞表面标志Flk-1,并计算阳性细胞百分数;20天后运用流式细胞术检测诱导后的细胞表达CD31和vWF情况。倒置相差显微镜下观察细胞形态改变。 结果: ①诱导分化后细胞形态学改变:倒置相差显微镜下,实验组1(LPS0.00μ g/mL)中细胞在培养基内呈贴壁生长,经VEGF和bFGF诱导后,原代细胞多呈圆形和梭形,接着形成细胞集落,随后可见部分细胞融合,细胞呈铺路石样排列生长。实验组2-5:(LPS0.01-10μg/mL)倒置相差显微镜下,PBMCs诱导分化过程中细胞形态与实验组1基本相同,均经历了小圆形→梭形→扁平细胞的演变过程。但实验组2(0.01μg/mL LPS)贴壁的细胞更多,最后形成的梭形细胞数量也最多;实验组3至实验组5,随着LPS浓度的增加,贴壁细胞及梭形细胞数量呈现递减趋势。 ②流式细胞检测结果显示,体外经VEGF和bFGF诱导分化后,与对照组相比,实验组1 FLK-1阳性细胞、CD31/vWF双阳性细胞数量明显增高,差异有统计学意义,与实验组1相比较,0.01μg/mL LPS干预组 FLK-1阳性细胞、CD31/vWF双阳性细胞升高明显,差异有统计学意义,而0.10μg/mL LPS对FLK-1阳性细胞、CD31/vWF双阳性细胞呈下降趋势,但差异无统计学意义,1.00μg/mL和10.00μg/mL LPS干预组FLK-1阳性细胞、CD31/vWF双阳性细胞明显下降,差异有统计学意义。 结论:可通过密度梯度离心法和贴壁黏附培养法相结合从外周血中分离、纯化获取外周血单个核细胞。体外培养的外周血单个核细胞通过血管内皮生长因子和碱性成纤维生长因子的诱导,成功分化为血管内皮细胞,提示外周血单个核细胞可作为糖尿病足治疗的细胞资源。0.01μ g/mL的 LPS能够最大限度地促进PBMCs向内皮细胞的分化,随着LPS浓度的增加,PBMCs的分化呈抑制作用,提示临床上有效控制LPS浓度后可提高PBMCs移植治疗糖尿病足的移植效率。