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本研究分为两个部分：一、乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA (HBV cccDNA)耐药相关位点变异检测方法的建立；二、慢性HBV感染者肝细胞内cccDNA耐药相关位点变异的检测及其与外周血HBV DNA序列的比较。一、HBV cccDNA耐药相关位点变异检测方法的建立目的建立HBV cccDNA核苷类似物耐药相关位点变异的检测体系。方法①设计2对跨双缺口引物以扩增HBV cccDNA、2对非跨双缺口引物扩增松弛环状DNA (rcDNA),所有引物扩增的片段涵盖拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦常见已知耐药位点。以梯度稀释的pBS HBV3.6Ⅱ质粒为标准品,筛选出聚合酶链反应(PCR)的最佳退火温度、Mg2+和二甲基亚砜(DMSO)的浓度、巢式PCR反应的循环次数、反应条件,了解PCR、巢式PCR的敏感度。②以梯度稀释的血清HBV DNA为对照品,了解跨双缺口引物对HBV cccDNA和rcDNA的区分度。③以不降解质粒的ATP依赖DNA酶(PSAD)分别消化不同浓度的pBS HBV3.6Ⅱ质粒及血清HBV DNA;定量检测消化前后DNA载量。④以慢性HBV感染者肝移植时的病肝为标本,采用十二烷基硫酸钠(SDS)-蛋白质沉淀法结合QIAamp柱法DNA提取试剂盒分离提取肝内HBV cccDNA和rcDNA, PSAD酶切纯化提取产物。通过实时荧光定量PCR分别定量上清和沉淀中的HBV cccDNA和rcDNA,分析消化液加蛋白酶K与否对提取结果的影响。⑤以按DNA聚合酶试剂的标准体系进行的单轮PCR(40个循环)的测序结果为参照,了解按调整Mg2+和DMSO浓度后反应体系后的巢式PCR对测序结果的影响。结果①该体系的最佳Mg2+浓度和DMSO浓度分别为2mM、2%；巢式PCR以第一轮进行20循环后,把产物稀释10倍作为第二轮PCR反应的模板、进行38个循环反应的结果为佳。②本实验条件下用该方法,低至103拷贝/ml的cccDNA分子经巢式PCR后,其产物量符合测序要求,且5×106拷贝/ml的血清HBV DNA经上述反应后未见阳性条带。③血清HBV DNA在PSAD酶切后下降100倍左右,PSAD酶对cccDNA无明显酶切效果。④采用SDS-蛋白质沉淀法结合柱法DNA提取试剂盒分离提取肝组织内的病毒时,初次消化不加蛋白酶K并不影响上清中HBV cccDNA的得率：同时有利于提高沉淀中HBV rcDNA的得率,从而提高沉淀中rc DNA与cccDNA的区分度。⑤加用了DMSO的巢式PCR并不影响后续测序结果的可靠性。结论该体系可用于肝细胞内的乙型肝炎病毒cccDNA的核苷类似物耐药相关位点变异检测,操作方便,特异性高,敏感性较好,测序结果可靠。【关键词】肝炎病毒；乙型；cccDNA;聚合酶链反应；变异二、慢性HBV感染者肝细胞内cccDNA耐药相关位点变异的检测及其与外周血HBV DNA序列的比较。目的证实慢性HBV感染者肝组织内HBV cccDNA存在核苷类似物耐药相关位点变异,了解肝内HBV变异病毒株与血中的异同。方法①以40例慢性HBV感染的肝移植者术前的血清、手术切下非瘤肝组织为标本。②以直接煮沸法提取血中HBVDNA,以PCR-直接测序法检测其基因序列。③采用SDS-蛋白质沉淀法结合柱法DNA提取试剂盒分离提取肝内HBV cccDNA和rcDNA,并以PSAD酶酶切纯化,对上清和沉淀中的产物进行实时荧光定量PCR检测,了解提取效果。以论文第一部分所建的PCR方法分别扩增上清中HBV cccDNA和沉淀中HBV rcDNA中的目的基因片段,产物行DNA测序。④对肝内HBV cccDNA. HBV rcDNA和血清中HBV DNA的基因序列对比分析。结果①40例患者中,有21例血清HBV DNA阳性,有31例患者肝内HBV cccDNA阳性,有37例患者肝内HBV rcDNA阳性,这些病毒阳性标本均成功测序。②测序结果表明有2例患者肝内HBV cccDNA、HBV rcDNA和血清中HBV DNA均有rtM204I变异；有2例患者肝内分别存在rtM204I、rtQ215H变异,而血清标本未检测到相应变异；3例患者血清中分别表现存在rtM204V、rtM204V、rtV173L+rtL180M+rtM204V变异,而肝内未检测到相应变异。除耐药相关变异外,大部分病例还存在其它位点变异。③大多数病人肝组织内HBV cccDNA病毒株并非单一。结论慢性HBV感染者肝细胞内cccDNA存在耐药相关位点变异,肝内的HBVDNA优势株与血中的不完全一致。肝组织内存在一种以上的HBV复制模板。