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丙酮酸作为重要的原料和中间体,广泛应用于化工、医药、农业等领域。传统的酒石酸脱水脱羧法生产工艺操作简单,但存在污染严重、产率低、原料消耗大等问题,导致丙酮酸及其衍生产品价格较高。近年来,丙酮酸的生物法制造技术由于原料成本低、反应条件温和、产品安全可靠等优点,引起产业界的广泛关注。生物法包括糖质原料发酵法和乳酸的酶催化氧化法两类。由于细胞内与丙酮酸相关的代谢途径活跃,限制了丙酮酸发酵水平的提高,而且由于丙酮酸在水溶液中溶解度大,从成分复杂的发酵液中分离丙酮酸成本较高,发酵法生产丙酮酸一直难以大规模工业化。以短链L-2-羟基酸氧化酶为基础的生物催化法由于无需添加昂贵的辅酶、催化体系简单且产品分离纯化方便,具有较好的工业应用前景。但是,催化的过程中产生的副产物过氧化氢容易将丙酮酸氧化成乙酸和二氧化碳,导致产率的降低。光学纯L-酪氨酸及其衍生物常被用于合成一些重要的药物,例如帕金森药L-多巴和抗肿瘤药物沙弗拉霉素A等。化学从头合成酪氨酸衍生物需要多个步骤,最终产物也是外消旋体,需要进行后期的拆分。酪氨酸酚裂解酶可直接催化丙酮酸、苯酚衍生物和氨生成L-酪氨酸衍生物,是一种极具前景的L-酪氨酸衍生物绿色合成途径。但是由于供体底物丙酮酸成本较高且不稳定,该方法和化学法相比竞争性仍不显著。生物催化级联反应因为具有克服中间产物的毒性和不稳定性、降低中间底物和产物分离纯化成本以及提高催化效率等优点,已经被广泛应用于高附加值化学品的合成。针对上述问题,本论文开发了两种催化级联反应体系:1)将短链L-2-羟基酸氧化酶催化的乳酸氧化脱氢反应和过氧化氢酶催化的过氧化氢分解反应相偶联,构建了能够将廉价的生物基原料L-乳酸氧化成丙酮酸的大肠杆菌全细胞催化剂。2)将上述体系进一步与酪氨酸酚裂解酶催化的C-C耦合反应相偶联,构建了一种包含L-2-羟基酸氧化酶、过氧化氢酶以及酪氨酸酚裂解酶的三酶级联反应体系,以L-乳酸和苯酚衍生物为出发底物,一锅法制备L-酪氨酸衍生物。首先,通过文献调研以及基因挖掘克隆了6种短链L-2-羟基酸氧化酶以及10种单功能过氧化氢酶,并分别从中筛选出催化活力高且稳定性好的来源于Aerococcus viridans 的乳酸氧化酶 AvLOX 以及来源于 Ureibacillus thermospAhaericus的过氧化氢酶UtCAT。其中,AvLOX在大肠杆菌中表达时包涵体比例较高,为了提高酶活,采用降低表达温度和诱导剂浓度、RBS序列定向进化和共表达分子伴侣的策略增强其可溶性表达。通过降低表达温度和诱导剂浓度,可溶性提高了3.4倍,酶活提高了48.9%;通过对RBS序列定向进化,成功获得了有利于AvLOX可溶性表达的RBS突变序列GGGGGC,携有该突变序列的重组菌E coli-pET28a-T7rbsAvLOX中目标酶的可溶性提高了 1.7倍,酶活提高了62.7%;在此基础上,进一步共表达分子伴侣GroES-GroEL,可溶性提高了 1.8倍,酶活提高了43.1%,最终AvLOX可溶性由8.5%提高到89.2%,酶活由4.5 U/mL提高到15.6 U/mL。然后,采用UtCAT与AvLOX粗酶液构建了胞外的双酶级联反应体系,确定了 UtCAT与AvLOX的酶活最优配比为300:1,以500 mM L-乳酸为底物收率能够达到92.3%,是不添加过氧化氢酶时(7.3%)时的12.6倍。为了简化工艺、提高偶联效率和降低成本,将AvLOX与UtCAT在E.coli BL21(DE3)内进行共表达,以pET28a-T7rbsAvLOX为质粒骨架构建了胞内双酶级联的全细胞催化剂。采用三种不同的单质粒共表达策略,其中共表达菌株五.coli-pET28a-T7rbsAvLOX-rbsUtCAT双酶表达效果最好。为了进一步提高过氧化氢酶酶活,利用RBS计算软件对UtCAT基因前的RBS序列进行重新设计,获得了翻译起始速率显著增强的序列RBS3,可使UtCAT酶活提高了 1.8倍,最终共表达菌株E.coli-pET-28a-T7rbsAvLOX-rbsUtCAT 中 UtCAT 和 AvLOX 的酶活分别达到4127.3 U/mL 和 12.6 U/ml(酶活比 328:1)。对 E.coli-pET-28a-T7rbsAvLOX-rbs3UtCAT的催化工艺进行了优化,获得的最佳的工艺条件为:反应温度37℃C,体系pH7.0,菌体添加量20 g/L以及0.7 Mpa氧气压力,其中氧气浓度是L-乳酸氧化反应的限制因素。在该条件下,500mML-乳酸仅需要1.5h即可被转化,收率达到92.2%。同时,考虑到维持氧气压力对设备有一定要求,在常压条件下建立了底物分批补料催化工艺,在L-乳酸总浓度为600 mM的反应中丙酮酸收率能够达到90.8%。然后,表达了来源于Symbiobacterium toebii的热稳定型酪氨酸酚裂解酶(Thermophilic tyrosine-phenol lyase,TTPL)并分析了 底物谱,发现 TTPL 可以催化苯酚、以及邻位时OH和F的2-羟基苯酚和2-氟-苯酚,但是将邻位取代基换成Cl、Br、CH3以及OCH3后TTPL就丧失了对底物的催化能力。为增强TTPL对不同底物的适应性,对其进行理性设计改造。基于同源建模与分子对接模拟分析,通过定点突变将TTPL中对底物特异性起决定作用的口袋进行扩大,构建了10个突变株,从中成功筛选出3个对2-甲基苯酚有较高催化活力的突变株F37V、T126S和M380V。底物特异性研究表明,突变株F37V和M380V表现出更宽的底物谱以及不错的催化活力。最后,以2-氟-苯酚为模式底物,构建了基于AvLOX、UtCAT以及TTPL M380V的三酶级联反应体系,其最佳的工艺条件为:反应温度40℃,体系pH 8.0,E.coli-pET28a-T7rbsAvLOX-rbs3UtCAT 与E.coli-pET28a-TTPLM380V 菌体添加比为1:2,湿菌添加总量为25g/L,底物浓度为46mM,该条件下3-氟-L-酪氨酸的收率由83.1%提高到97.1%,ee值>99%。以此为基础,通过改变热稳定性酪氨酸酚裂解酶突变子种类,还可以催化合成5种其它L-酪氨酸衍生物,收率达到81.1-96.3%,ee值均大于99%。采用底物流加补料催化工艺,在0.5 L规模反应中,上述反应的底物酚转化率分别达到77.4～94.3%,产物浓度达到48.0～60.4g/L,成功解决了底物抑制、催化剂不稳定和收率低等问题,展示出良好的工业应用前景。