随着对玉米需求量和品质要求的不断提升,快速有效地创制优良玉米新种质已经成为玉米分子育种的重要任务。植物组织培养与基因工程技术在转基因育种中的应用有效地促进了植物分子育种的发展。然而,植物组织再生培养有着明显的基因型依赖性特征,这也限制了玉米转基因育种的快速发展。本实验室从200份玉米骨干自交系中筛选出遗传转化效率高的玉米自交系Y423,Y423有着高体胚诱导率特征,在没有外源激素的分化培养基中能够同时分化出根和芽,形成完整的植株,且移栽成活率高。为了探究玉米体胚发生过程中的细胞内源激素代谢调控以及复杂分子调控机制,本研究进行了体细胞胚胎发生的转录组分析及相关基因的克隆,为今后的玉米遗传转化及分子育种奠定理论基础。激素是体胚诱导过程中重要的调节因子。外源激素的施加会引起内源激素代谢水平的变化,从而诱导体细胞获得胚性能力,形成体胚。实验采用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)对内源IAA、ABA以及CTK在体胚发生过程中的浓度水平进行测定。结果表明在外源激素2,4-D的刺激下,细胞内激素水平发生显著变化,而各种激素间的相互平衡使得细胞脱分化最终形成体细胞胚胎。为了解玉米体细胞胚胎发生的分子机制,实验利用RNA-seq技术对来自玉米自交系Y423的幼胚(IE)、胚性愈伤组织(EC)、体细胞胚胎(SE)进行转录组分析。两个差异表达数据库(IE-vs-EC、IE-vs-SE)中的差异表达基因(DEGs)分别为3844和7449个。比较胚性愈伤组织与体胚的基因表达水平时,发现了260个DEGs显著差异表达。通过层次聚类算法分析,将筛选后的6888个DEGs的基因聚类到8个表达模式组中。分析发现,体胚发生相关的一些基因主要聚类到E或F组中,这些基因在体胚诱导过程中大多呈现出上调表达。Gene Ontology(GO)注释与KEGG pathway分析表明,E和F组中的DEGs大多与激素信号转导、胁迫响应以及代谢有关。在差异表达的转录因子中,主要的一些转录因子家族与胁迫响应有关,参与了细胞分化、胚胎发生及胚胎成熟。一些激素生物合成、激素极性运输、信号转导、代谢相关基因参与了玉米体胚发生分子调控。利用q RT-PCR对9个候选基因在玉米体胚发生过程中的表达模式进行分析,结果表明这9个基因可能在玉米体胚发生过程中起到重要的正调控作用。利用RT-PCR技术成功克隆了5个体细胞胚胎发生相关的候选基因并构建了植物表达载体,分别为:Pro35S:BAK1:GFP、Pro35S:Zm LBD17:GFP、Pro35S:Zm MADS11:GFP、Pro35S:RTCS1:GFP和Pro35S:Zm LBD24:GFP。对这5个基因进行生物信息学与功能分析,推测这几个候选基因可能参与调控体胚发生。5个表达载体均通过农杆菌介导侵染了拟南芥,获得Zm MADS11、RTCS1 T1代阳性拟南芥植株。异位表达Zm MADS11基因促进拟南芥在没有外源激素的培养下根部产生自发愈伤组织。综上所述,本文对玉米体细胞胚胎发生过程中的内源激素浓度的动态变化进行了测定。利用转录组数据对玉米体胚发生相关的信号通路以及基因表达调控网络进行分析。同时对筛选的候选基因在体胚诱导过程中的表达模式进行分析。克隆了5个候选基因,并进行了功能验证。