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急性病毒性心肌炎(AVMC)是心血管系统的常见病,好发于青壮年,虽然大多数预后良好,但约25%左右的患者仍可进展为扩张型心肌病,后者病死率高。由于对其发病机制尚不明了,至今尚无有效的治疗手段防止其病情恶化。病毒持续感染诱发免疫炎症反应,导致心肌细胞凋亡坏死被认为是AVMC发病的主要机制。病毒感染诱发的炎症反应主要表现为巨噬细胞、NK细胞等炎症细胞的浸润和炎症因子的释放,这是机体重要的防御方式,有助于病原体的清除,然而在AVMC中往往存在着“过度”的炎症反应,加重心肌的病变。髓系触发受体-1(TREM-1)是激发、放大炎症反应的重要介质,有促进炎症因子分泌的作用,能诱导单核巨噬细胞和中性粒细胞分泌TNF-α, IL-2, IFN-γ等炎症因子,还能诱导中性粒细胞释放髓过氧化物酶,最终导致炎症反应的增强和放大,引起“过度”的炎症反应。TREM-1是否在急性病毒性心肌炎中起到作用,引起过度的炎症反应,加重了心肌细胞的损伤?目前尚无文献报道。本实验室前期实验己用WesternBlot方法在急性病毒性心肌炎的动物模型上检测到AVMC小鼠心肌组织中TREM-1蛋白表达量增多,TREM-1的表达量与心肌组织病理积分和心功能呈正相关,阻断TREM-1的活化,可降低心肌组织内IL-1, TNF-a的水平,降低心肌组织病理积分,减少心肌细胞凋亡,并显著改善心功能。由于既往研究表明TREM-1常规表达在中性粒细胞、巨噬细胞等髓系细胞表面,而巨噬细胞是急性病毒性心肌炎发病中重要的炎症细胞,因此本实验将研究在急性病毒性心肌炎中,TREM-1是否确实表达于心肌组织浸润的巨噬细胞表面,并在体外细胞模型上研究TREM-1对巨噬细胞分泌炎症因子和心肌细胞损伤的作用。第一部分急性病毒性心肌炎中TREM-1在心肌组织中的表达定位目的检测CVB3感染导致的急性心肌炎小鼠心肌组织中TREM-1的表达。方法以CVB3单次感染BALB/c小鼠建立急性病毒性心肌炎模型(n=10),同期小鼠腹腔无菌注射等剂量不含病毒的DMEM液作为正常对照组(n=8)。在接种病毒后第7天处死小鼠,HE染色观察心肌病理形态学改变；用免疫组化的方法检测AVMC心肌组织中TREM-1的表达；用免疫荧光双标染色和共聚焦扫描的方法检测小鼠心肌组织同一部位TREM-1蛋白及巨噬细胞表面标志CD68的表达,用图像融合技术比较两种蛋白的表达是否一致。结果与对照组相比,模型组小鼠心肌HE染色可见明显的炎性细胞浸润和心肌坏死等炎症改变。免疫组化检测到急性病毒性心肌炎小鼠心肌组织中有TREM-1蛋白表达,共聚焦检测进一步证实急性病毒性心肌炎小鼠心肌组织中TREM-1的表达与巨噬细胞表面标志CD68的表达大部分重合。结论用CVB3单次腹腔注射的方法成功建立了急性病毒性心肌炎模型,急性病毒性心肌炎小鼠心肌组织中存在TREM-1蛋白表达,且大部分表达在炎症浸润的巨噬细胞表面。第二部分TREM-1在CVB3感染巨噬细胞和损伤心肌细胞中的作用目的通过体外观察CVB3感染的巨噬细胞和心肌细胞表达TREM-1的情况,研究TREM-1对巨噬细胞分泌炎症因子和其在心肌细胞损伤中的作用。方法体外培养巨噬细胞后,取CVB3感染不同时间点,利用Real-time PCR方法检测TREM-1mRNA的表达,免疫印迹法检测TREM-1及其下游分子DAP-12的表达,然后通过TREM-1竞争性拮抗剂LP-17阻断TREM-1的活化,用ELISA方法测定巨噬细胞分泌TNF-a的变化,用CCK8试剂盒和Annexin-FITC检测阻断前后巨噬细胞上清与心肌细胞共培养后,心肌细胞的活性和凋亡的变化。同样,体外培养心肌细胞,取CVB3感染不同时间点,利用Real-time PCR方法检测心肌细胞中TREM-1mRNA的表达,用免疫印迹法检测TREM-1及其下游分子DAP-12的蛋白表达,用LP-17阻断TREM-1后再用CVB3感染,与单纯CVB3感染相比较,用Real-time PCR检测并比较心肌细胞内病毒RNA复制的变化,用CCK-8试剂盒检测心肌细胞活性的变化。结果CVB3感染后4h、8h和12h巨噬细胞表达TREM-1mRNA的量升高,其中后两组升高有显著差异(p<0.01),16h和24h时TREM-1蛋白表达显著增多,24h和48h时TREM-1的下游信号分子DAP-12的蛋白表达也显著增加；用LP-17阻断巨噬细胞的TREM-1活化后再感染CVB3,结果发现,巨噬细胞分泌的TNF-a的量较单纯CVB3感染时显著减少(p<0.05),巨噬细胞上清与心肌细胞共培养,与和单纯CVB3感染的巨噬细胞上清共培养相比,心肌细胞的活力明显升高(p<0.01),凋亡减少(p<0.01)。CVB3感染心肌细胞后2h心肌表达TREM-1mRNA的量升高(p<0.01),8h、12h和24h时TREM-1蛋白表达显著增多,以12h最为明显,同时,8h、12h、24h时DAP-12的蛋白表达也显著增加；CVB3感染12h后,细胞免疫荧光也可检测出心肌细胞中TREM-1的阳性表达；用LP-17阻断TREM-1后再用CVB3感染,与单纯CVB3感染相比较,心肌细胞内CVB3复制的病毒RNA量明显减少(p<0.01)；且心肌细胞的活性明显升高(p<0.01)。结论CVB3体外感染后,巨噬细胞和心肌细胞表达TREM-1增多,阻断TREM-1的活化可使巨噬细胞分泌炎症因子减少,病毒在心肌细胞中的复制减少,心肌细胞的损伤和凋亡减轻。