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背景:原发性肝癌(简称肝癌)是导致癌症相关性死亡的第二大原因,其中以肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)占比最高,中国肝癌患者占全球的一半,其中仅有约15%的患者在可接受治愈性干预的早期阶段被诊断。对于晚期肝癌患者,临床上唯一批准的一线治疗药物索拉菲尼也仅使其中位生存期延长了3个月,且存在一定的耐药性和副作用,因此对于中晚期HCC患者有限的治疗手段增加了开发新的治疗方法的必要性。肿瘤微环境(TME)这一复杂的综合系统正在被逐步研究,由于我国肝癌患者以乙型肝炎背景居多,肝癌的发生发展与微环境中的免疫逃避等密切相关,这也是多种治疗方法失效的原因之一。中医药以其复方联合、多靶点干预的优势,在多种肿瘤的防治中发挥越来越重要的作用。课题组在长期临床实践中总结出经验方“解毒方”(Jiedu Fang,JDF),临床上用于多种肿瘤尤其是肝癌取得了较好的疗效,JDF联合介入术较单独使用介入术能显著延长不能切除的肝癌患者生存时间,其作用与改善肝癌炎性微环境相关。在预实验中,通过细胞因子芯片我们发现解毒方能有效抑制M2型巨噬细胞活化,其作用靶点可能为胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP2),现有文献报道该因子对多种肿瘤的发生发展起着重要作用,但在肝癌中的作用及具体分子机制仍不清楚,因此,本研课题主要验证JDF能否通过IGFBP2这一靶点发挥抑制肝癌增殖、迁移及侵袭的效应,以及该效应的具体分子机制。研究目的:1.观察IGFBP2对肝癌细胞增殖、迁移及侵袭的作用。2.明确JDF是否能抑制IGFBP2诱导的肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的效应及作用机制。研究方法:1.通过Human XL Cytokine Array Kit试剂盒检测JDF对M2型巨噬细胞细胞因子分泌的影响,筛选出可能的作用靶点IGFBP2,并通过Western Blot检测IGFBP2在正常肝细胞及多种肝癌细胞系中的表达。2.通过转染IGFBP2过表达质粒及沉默IGFBP2,从正反两方面验证IGFBP2对肝癌细胞增殖、迁移及侵袭的作用。3.通过MTT实验、平板集落形成实验及软脂胶集落形成实验验证JDF对肝癌细胞增殖及克隆形成的作用,同时检测IGFBP2对肝癌细胞增殖的影响及JDF的拮抗作用。4.通过Transwell小室迁移和侵袭实验,观察IGFBP2是否能促进肝癌细胞的迁移和侵袭,同时JDF能否拮抗IGFBP2该效应。5.通过人基因表达谱芯片分别检测正常Huh 7细胞对照组及IGFBP2作用组基因表达的不同,通过数据富集及Ingenuity Pathway Analysis(IPA)分析,筛选出IGFBP2可能作用的信号通路。6.通过Western Blot及ELISA等实验方法,检测IGFBP2对EMT相关蛋白如E-cadherin,N-cadherin,Vimentin,Snail,Twist表达的影响,同时检测基质金属蛋白酶MMP 2和MMP 9的表达,并探索是否通过p-AKT及p-ERK信号通路起作用,最后验证JDF对上述信号通路的拮抗作用。7.采用人肝癌裸鼠皮下瘤模型、裸鼠肝原位移植瘤模型及裸鼠肺转移瘤模型进一步在体内验证IGFBP2的作用及JDF的拮抗效应。结果:1.Human XL Cytokine Array Kit试剂盒检测结果提示M2型巨噬细胞条件培养基中,BAFF、Complement Component C5/C5a、IGFBP-2等基因表达上调,而GM-CSF、G-CSF、IL-4基因则下调,而JDF能拮抗上述基因的表达。结合文献分析,IGFBP2可能是JDF发挥效应的有效靶点。Western Blot结果显示IGFBP2在正常肝细胞中表达很低,在肝癌细胞系中,其在Huh 7细胞中表达最低,而在MHCC 97H细胞中表达最高。2.MTT实验结果提示JDF能有效抑制肝癌细胞的增殖,且呈现一定的时间和剂量依赖性,当JDF浓度为1.2 mg/mL时其增殖抑制有统计学差异,而当JDF浓度为0.8 mg/mL且作用时间为24 h时其增殖率为94.74%,与空白对照组相比差异无统计学差异。另一方面,IGFBP2能促进Huh 7细胞和MHCC 97H细胞的增殖,且呈一定的时间和剂量依赖性。对于Huh 7细胞,当作用24 h、48 h、72 h时其最高增殖率分别为122.37%、125.85%及146.20%;而对于MHCC 97H细胞,当作用24 h、48 h、72 h时其最高增殖率分别为111.92%、110.27%及117.15%。集落形成实验提示人重组细胞因子IGFBP2或转染过表达IGFBP2质粒均能促进Huh 7细胞平板及软脂胶集落形成,尽管其集落形成数目较空白对照组无明显差异,但其集落形成的平均面积较空白对照组显著增大,而沉默IGFBP2及JDF均能拮抗上述效应。3.Transwell小室结果显示不同浓度的IGFBP2(50 ng/mL及100 ng/mL)作用于Huh 7细胞24 h后,均能促进细胞的迁移与侵袭,且当IGFBP2作用浓度为100 ng/mL时其与对照组的差异具有统计学意义(P<0.05);转染过表达IGFBP2质粒后,Huh 7细胞的迁移和侵袭能力较空载体细胞明显增强(P<0.05);而JDF能有效拮抗IGFBP2促进迁移和侵袭的效应。通过慢病毒转染沉默MHCC 97H细胞中的IGFBP2表达后,其迁移侵袭能力较空载体细胞明显下降(P<0.05)。4.人基因表达谱芯片提示IGFBP2作用于Huh 7细胞后,其差异表达基因与肿瘤最相关,且与细胞运动调节失常密切相关,通过经典信号通路分析,提示IGFBP2显著激活Oxidative Phosphorylation,且ERK和AKT信号通路发挥了重要作用。Western Blot实验结果显示IGFBP2能抑制E-cadherin的表达,同时上调N-cadherin,Vimentin,Snail和Twist的表达,而JDF及沉默IGFBP2均能拮抗上述效应。另一方面,IGFBP2还能激活AKT和ERK的磷酸化,且作用时间为60 min时其效应最明显。而PI3K和MEK和ERK抑制剂能拮抗该效应,并能拮抗IGFBP2诱导的Huh 7细胞的EMT。5.通过MHCC 97H细胞建立的人肝癌裸鼠皮下瘤模型结果显示JDF治疗后裸鼠肿瘤大小及净重、血清中IGFBP2的含量均比空白对照组明显降低,转染了IGFBP2RNAi的裸鼠相较于转染空载体的MHCC 97H-luc-control肿瘤大小及净重、血清中IGFBP2的含量亦明显降低,而MHCC 97H-luc-control与空白对照组的肿瘤大小及净重无明显差异。免疫组化结果显示JDF及IGFBP2 RNAi均能有效抑制PCNA的表达,同时能诱导E-cadherin的上调而抑制N-cadherin、Vimentin、Snail及MMP 2和MMP9的表达。裸鼠Huh 7细胞建立的肝原位移植瘤模型结果显示过表达IGFBP2相较于空载体的对照组能使肿瘤的大小及净重明显增加,而JDF能明显拮抗IGFBP2的这种效应,空载体的对照组与空白对照组相比肿瘤大小无明显差别。免疫组化结果显示JDF能有效抑制PCNA的表达,同时诱导E-cadherin的上调,而抑制N-cadherin、Vimentin、Snail及MMP 2和MMP 9的表达,过表达IGFBP2则与JDF的效应相反,其能有效促进PCNA的表达及EMT,而在过表达IGFBP2的同时以JDF干预则能部分拮抗这种效应。裸鼠MHCC 97H细胞建立的肺转移瘤模型结果亦显示JDF及沉默IGFBP2均能有效抑制肝癌的肺转移,免疫组化结果显示其效应与抑制EMT及MMP2和MMP 9的表达相关。结论:1.IGFBP2在体内外均能促进肝癌的增殖和转移,而这一作用能被JDF所抑制。2.IGFBP2可能通过激活PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路促进了肝癌EMT,JDF能抑制IGFBP2的该效应并发挥抗肝癌的效应。