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随着糖尿病慢性并发症研究的逐步深入,糖基化终产物(Advanced Glycation End Products,AGEs)在糖尿病并发症中所起的作用越来越受到重视。国内外非常关注糖基化终产物和糖基化终产物受体RAGE(Receptor of advanced glycation end products,RAGE)的研究,特别是在糖尿病血管并发症中,但AGEs的积累和RAGE表达的关系以及高糖和AGEs联合损伤血管细胞都未见报道。本文旨在研究AGEs积累与RAGE表达的关系并探讨高糖和AGEs联合作用对血管细胞的影响。全文从三个水平进行了初步研究,包括 体外水平:建立体外非酶糖化(Nonenzymatic Glycation)系统,制备糖基化终产物,检测随着时间的延长糖基化终产物的形成过程和发展状况,为了解体内糖基化终产物的积累过程提供一些实验依据。将100mmol/l葡萄糖与50g/l牛血清白蛋白(BSA)在37℃条件下制备非酶糖化产物,分别于0、2、4、6、8、10、12周取样,于-20℃保存,同时以37℃孵育52周的100mmol/l葡萄糖与50g/l BSA作为阳性对照,检测产物的棕色反应、荧光反应、果糖胺的含量、ELISA反应并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法分析其组份的变化。实验结果发现随着孵育时间的延长,体外孵育AGEs的量随之增加,形成速度加快:棕色产物、荧光产物的含量,ELISA反应的值持续增加,两周内果糖胺的含量迅速增加,之后趋于稳定;电泳结果表明蛋白交联的程度逐步增大。 动物水平:检测鼠体内糖基化终产物的积累情况并研究其与糖基化终产物受体表达水平之间的关系。以正常的和四氧嘧啶(alloxan)诱导Ⅰ型糖尿病模型小鼠以及正常大鼠为实验对象,用制备的兔抗AGEs-BSA多抗通过ELISA的方法检测小鼠和大鼠各器官糖基化终产物的积累情况,并用RT-PCR的方法检测大鼠各脏器糖基化终产物受体的表达情况。实验结果发现在小鼠体内AGEs广泛积累,Ⅰ型糖尿病模型小鼠与正常小鼠相比,多个脏器和组织积累的AGEs含量明显升高。在正常大鼠体内,RGAE的表达量越高AGEs的积累量越低,反之亦然。 细胞水平:研究糖基化终产物和高浓度葡萄糖对血管细胞的损伤及对其糖基化终产物受体表达的影响。以体外培养的牛主动脉血管内皮内皮细胞、血管平滑肌细胞为实验对象,加入AGEs、高浓度葡萄糖以及两者的共同作用作为损伤剂,利用生化方法测定细胞乳酸脱氢酶(LDH)、还原型谷胱甘肽(GSH)和NO2-/NO3-的含量,用MTT法测定细胞的活性,用CELL-ELISA和RT-PCR检测细胞RAGE的表达。实验结果发现与正常组相比,高糖组、AGEs组和联合损伤组对主动脉内皮细胞的生长有明显的抑制作用和对平滑肌细胞的生长有明显的促进作用,主动脉血管细胞LDH的泄漏量明显增高,GSH和NO2-/NO3-的含量明显减少,且联合损伤组作用最明显。同时,联合损伤组血管细胞的RAGE表达水平明显比