制作转基因动物的传统的方法是通过随机插入的方式将表达单元整合入基因组中。尽管这种方式简便、直接,但是存在着固有的缺陷,表达单元的拷贝数和整合位点都无法准确地控制,容易造成外源基因表达的不稳定及影响内源基因的表达。为了克服随机插入的局限,近年来科学家们广泛采用定点插入的方式,通过同源重组的方法,使外源基因以单拷贝形式整合于基因组中特定的位点。然而,对于基因组序列非常长的基因而言,实现其基因组序列的定点插入存在很大的难度。虽然可以选择用cDNA替代其基因组DNA序列,进行打靶载体的构建,但与基因组DNA序列相比,cDNA序列可能缺少某些存在于内含子中的、尚未发现的、却发挥着重要功能的调控元件,因此大多数情况下,cDNA的使用并不利于目的基因的高水平表达。Igf1是调控肌肉生长和发育的关键基因,肌肉组织特异地过表达IGF1能够促进肌肉肥大。Igf1的基因组DNA序列大于70 Kb,目前尚无利用Igf1基因组DNA序列实现其过表达的报道。现有的Igf1转基因小鼠模型多采用随机整合编码IGF1前肽及成熟肽的cDNA的方式。本研究将Igf1基因作为一个例子,来验证能否通过在其转录起始位点上游定点整合增强子,上调IGF1的表达水平,从而获得预期的表型。在本研究中,我首先利用荧光素酶报告系统,评估了候选的MLC(Myosin light chain)增强子、MCK(Muscle creatine kinase)增强子对于Igf1启动子的增强效果。在分化的肌管中,与阴性对照载体相比,含有MCK增强子的荧光素酶载体的表达活性仅有少量提高(MCK增强子以3’-5’方向连入时,P<0.05;MCK增强子以5’-3’方向连入时,P>0.05),而含有MLC增强子的荧光素酶报告载体的活性为阴性对照的12-20倍(MLC增强子以3’-5’方向连入时,P<0.01;MLC增强子以5’-3’方向连入时,P<0.05)。因此,本研究选择了 MLC增强子用于后续实验。为了选取合适的增强子插入位点,尽量减少对Igf1转录起始位点上游内源的重要调控元件的破坏,本研究通过phastCons分值评估了Igf1转录起始位点上游100 Kb的区域的保守性,并选取了具有最低phastCons平均值的三个区域,或者说在进化上极不保守的三个区域,以此避开在进化上具有保守性功能的顺式调控元件。我将这三个候选位点命名为site1、site2、site3,它们分别距离转录起始位点约1.5 Kb、6 Kb、20 Kb。为了客观地评估各个候选插入位点的有效性,本研究利用CRISPR/Cas9介导的同源重组技术,筛选得到了三个候选插入位点分别整合MLC增强子序列的C2C12细胞单克隆,并检测了各系列的单克隆分化的肌管中的Igf1的表达量。结果显示,site1、site3系列单克隆分化的肌管中Igf1 mRNA的表达水平均发生下调,site2系列单克隆分化的肌管中无论Igf1 mRNA还是IGF1蛋白的表达水平均显著上调。由此可见,site2位点能够支持整合于此的MLC增强子发挥增强Igf1启动子的活性的作用,因此本研究选取了 site2位点作为增强子的插入位点用于制备基因修饰小鼠。通过将针对site2位点的sgRNA,Cas9 mRNA及同源重组载体共注射小鼠的受精卵,制作了site2位点整合MLC增强子的基因修饰小鼠。获得的基因定点修饰小鼠生长发育正常。与同性别同窝野生型小鼠相比,无论基因修饰的公鼠还是母鼠肌肉中的Igf1的mRNA(P<0.0001)及蛋白水平均发生显著上调(P<0.000001)。但值得注意的是,基因修饰母鼠肌肉中IGFI蛋白的水平为野生型的12.4倍,而基因修饰公鼠肌肉中IGF1蛋白的水平为野生型的4.6倍。基因修饰母鼠表现出明显的肌肉肥大的表型,基因修饰公鼠也表现出肌肉重增加及肌肉肥大的趋势,但在统计学上不显著(P>0.05)。与同窝野生型对照相比,基因修饰小鼠的血液中的IGF1水平未发生显著变化(P>0.05),心脏未出现肥大及病理的表型,胫骨长度未发生显著变化(P>0.05)。综上所述,本研究证明了通过在非编码区定点整合增强子,上调目的基因表达,并获得具有预期表型的动物的可行性。同时,本研究为未来在家畜大动物中利用类似方法改良相关生产性状提供了新策略。