背景细胞过氧化损伤是机体氧化与抗氧化系统失衡时过多氧自由基引起细胞功能及结构发生改变,进而造成神经、组织、器官损伤的过程。过氧化损伤是肝缺血再灌注损伤的主要病理生理基础之一。近年研究发现,在多种细胞内过氧化损伤可引起强烈的内质网应激反应(endoplasmic reticulum stress, ERS),由此引起的大量细胞凋亡可能影响肝脏缺血再灌注后的细胞功能乃至器官功能,因而ERS诱导的细胞凋亡可能是过氧化损伤致肝脏再灌注时细胞损伤发生的主要机制之一,采取有效措施抑制过强的ERS反应,有可能减轻肝细胞过氧化损伤,在一定程度上改善缺血再灌注损伤。未折叠蛋白反应是ERS的主要效应手段,其主要效应分子活化转录因子6(activating transcription factor-6, ATF-6)是内质网腔的Ⅱ型跨膜蛋白,是ERS发生的标志性蛋白之一。正常情况下ATF-6与葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein78, GRP78)结合处于惰性状态,在内质网功能异常时ATF-6与GRP78解离,并转移至高尔基体,裂解为ATF-6a,进入细胞核,激活多种ERS调节RNA,如X盒结合蛋白1(X-box binding protein1, XBP-1)、GRP78、 ATF-4mRNA等,以增强内质网蛋白的折叠能力,恢复细胞内质网稳态。当ERS过强或持续时间过长时,细胞内质网功能受损严重而无法恢复,ERS通过激活Caspase12等信号分子,启动细胞凋亡程序,最终激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase3, Caspase-3),诱导细胞凋亡。本课题组既往研究证实,丹参预处理可明显改善缺血再灌注时大鼠肝细胞内ERS及其所致的细胞凋亡,并减轻肝脏损伤。然而丹参是一味复合型中药,成分较为复杂,其主要作用成分还不得而知。丹酚酸A作为丹参的水溶性主要提取成分之一,其所具有的酚羟基基团具有确切的抗氧化损伤作用。为了进一步探讨丹参改善肝缺血再灌注损伤时ERS的分子机制,本课题组以人正常肝细胞-L02细胞株为研究对象,通过体外实验观察丹酚酸A在L02细胞过氧化损伤时对ATF-6α、GRP78和Caspase3的影响,验证丹参通过调节ESR对肝细胞所发挥保护作用的分子机制,为将国药丹参应用于肝脏缺血再灌注损伤防治提供依据。目前,国内外有不少体外实验采用过氧化氢(hydrogen peroxide, H2O2)处理L02细胞进行肝细胞过氧化损伤和不同干预措施保护细胞的分子机制研究,然而在诸多的细胞模型中使用H2O2浓度相差甚大,缺乏均一化的过氧化损伤细胞模型。我们在实验中感受到,H202浓度过小,对细胞作用甚微,其损伤机制、特别是干预措施的效果难以评估,而H202浓度过大,则可致细胞组织结构迅速破坏,细胞坏死,难以进行基因水平、蛋白质水平以及信号传导的相关检测分析。因此,建立稳定的肝细胞过氧化损伤模型,确定合适的H2O2损伤浓度及丹酚酸A作用浓度,对验证丹酚酸A抗细胞过氧化损伤的干预效果,准确深入地认识与肝细胞过氧化损伤有关的病理生理变化十分必要。因此,本课题首先观察不同浓度梯度H202和丹酚酸A分别作用于L02细胞后对细胞生长抑制率及细胞形态学变化的影响,通过筛查研究,建立合适的L02细胞过氧化损伤细胞模型并选取合适的丹酚酸A保护浓度,在此基础上,进一步研究丹酚酸A在L02细胞过氧化损伤时对ATF-6α、GRP78和Caspase3的影响,以实现本课题的研究目标。第一部分L02细胞过氧化损伤模型的建立及丹酚酸A的细胞保护作用一、目的：筛选适宜的H2O2和丹酚酸A作用于正常人肝细胞株(L02细胞)的浓度和作用时间,建立L02细胞过氧化损伤和丹酚酸A细胞保护作用体外实验模型。二、材料和方法：1.材料L02细胞株购自武汉大学保藏中心；丹酚酸A购自阿拉丁试剂公司；过氧化氢购自国药集团化学试剂有限公司;Dmem培养基购自Hyclone公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；胰酶、DMSO、MTT试剂购自AMRESCO公司。2.细胞复苏与培养将冻存好的L02细胞迅速放入37℃水浴箱中直至溶解,种于含10%胎牛血清的Dmem培养基中,于细胞培养箱中(37℃,5%C02)培养12h后更换新鲜培养液；待细胞铺满培养瓶80%-90%时,PBS洗2次贴壁细胞,0.25%的胰酶37℃消化至脱落,用含10%胎牛血清的Dmem培养基终止消化并制成细胞悬液,显微镜下血细胞计数板计数细胞,以1×104cell/ml浓度接种于6孔细胞培养板中,用于检测的细胞接种于已放置好无菌2x2cm2大小盖玻片的6孔细胞培养板中,每孔2ml,置于细胞培养箱中(37℃,5%CO2)培养。3.实验方法(1)H2O2对L02细胞过氧化损伤实验以常规培养的L02细胞为对照,分别用5、10、20、40、80、160、320、640、1280、2560、5120μmol/L H2O2处理常规培养的L02细胞,24h后用MTT实验检测各孔细胞平均吸光度值,选取合适的H2O2浓度用于下一步实验。(2)丹酚酸A对L02细胞生长状态的影响以常规培养的L02细胞为对照,分别用10、20、30、40nmol/L丹酚酸A处理常规培养的L02细胞,0、4、8、12、24h后用MTT实验检测各孔细胞平均吸光度值,确定应排除的丹酚酸A对L02细胞具有不利作用的浓度组。(3)丹酚酸A预处理对H202诱导L02细胞损伤的保护作用以常规培养的L02细胞为对照,剔除上一步实验中对L02细胞不利的丹酚酸A浓度组,用余下各浓度组的丹酚酸A分别预处理L02细胞,24h后加入含160μmol/LH202培养液,继续培养24h后用MTT实验检测各孔细胞平均吸光度值,选取其中丹酚酸A最佳保护浓度及作用时间进行正式实验。(4)数据用均数±标准差(χ±s)表示,采用SPSS13.0统计软件进行数据处理,实验结果采用析因设计与完全随机设计方差分析(组间比较：方差齐采用LSD法,方差不齐采用Games-Howell法),以P<0.05作为差异有统计学意义的判定标准。三、结果：(1)H202对L02细胞的损伤作用H202随着浓度逐渐增大,对细胞生长的抑制逐渐增强,整个过程中有3个平台期,相邻浓度间差异无统计学意义(P>0.05),分别是5-40μmol/L、160-320μmol/L以及640-1280μmol/L。5-40μmol/L时H202对细胞生长的抑制效果<10%,损伤效果过小,光镜下细胞生长状态与正常组无明显差异；640-1280μmol/LH2O2对细胞的抑制效果>60%,细胞损伤较重,镜下可见细胞生长稀疏,大量细胞破碎。仅在H202浓度为160-320μmol/L的组内,细胞生长抑制率为35%-40%,少量细胞破碎或漂浮,多数细胞仍可贴壁生长。故我们选取160μmol/L作为H202建立肝细胞过氧化损伤模型的适宜浓度。(2)丹酚酸A对L02细胞的影响各组浓度丹酚酸A处理L02细胞在Oh、4h细胞平均吸光度值差异无统计学意义(P>0.05);10nmol/L丹酚酸A在8h、24h时细胞平均吸光度值较对照组(0nmol/L)升高(P<0.05)；20nmol/L丹酚酸A在作用8、12、24h后细胞平均吸光度值高于对照组(P<0.01)。除了40nmol/L丹酚酸A在作用L02细胞12、24h细胞平均吸光度值明显低于对照组(P<0.05),提示此时该浓度丹酚酸A对细胞生存可能有不利影响；其余各组在各时间点细胞平均吸光度均略低于对照组或与对照组差异无统计学意义。而在所有浓度组中,20nmol/L丹酚酸A作用24h时在细胞平均吸光度值最高,提示此浓度丹酚酸A对L02细胞的促增殖作用最明显,镜下可见簇拥成团、增殖活跃的肝细胞。(3)不同浓度丹酚酸A预处理24h对L02细胞过氧化损伤的影响与对照组相比,丹酚酸A浓度为10nmol/L和30nmol/L时平均吸光度值在各时间点均明显低于对照组(P<0.05),镜下可见漂浮细胞及细胞碎片较对照组增多,而20nmol/L组仅在4h时与对照组差异有统计学意义(P<0.05),其余时间点吸光度值虽低于对照组,但差异无统计学意义(P>0.05),其中以24h细胞平均吸光度值与对照组最为接近,镜下见细胞贴壁生长,漂浮细胞及细胞碎片均较少,接近细胞正常生长。故选取20nmol/L丹酚酸A预处理24h进行正式实验。四、结论随着H202浓度逐渐升高,其对L02细胞作用依次表现为：无明显影响、细胞凋亡、细胞大量死亡,160μmol/L H2O2可造成部分细胞损伤、凋亡而未出现大片坏死,因此我们认为该浓度是建立肝细胞过氧化损伤体外模型的较适宜浓度。20nmol/L的丹酚酸A单独作用于L02细胞时具有促进细胞增殖作用,预处理L02细胞24h还可明显改善H202造成的过氧化损伤,提高细胞生存率,因此我们将其确定为体外细胞实验中探讨其保护作用分子机制的相对适宜浓度。第二部分丹酚酸A对L02细胞过氧化损伤时起始转录因子6α和葡萄糖调节蛋白78的影响一、目的通过同步观察L02细胞株过氧化损伤时ATF-6α、Caspase-3蛋白和GRP78mRNA的表达及丹酚酸A预处理对三者表达的影响,探讨L02细胞遭受过氧化损伤时ERS的特点及丹酚酸A的细胞保护机制。二、材料与方法1材料ATF-6a抗体购自美国Santa Cruz公司(货号：sc-166659); Caspase-3抗体购自武汉博士德生物有限公司(货号：BA2142)。2细胞培养同第一部分。3实验方法(1)丹酚酸A对ERS的影响将常规培养的细胞分为：①对照组(C组)：常规培养的L02细胞；②过氧化损伤组(H组)：160μmol/L H2O2处理常规培养的L02细胞24h；③丹酚酸A预处理组(R组)：20nmol/L丹酚酸A处理常规培养的L02细胞24h后,加入含160μmol/L H2O2的培养液。24h后收集各组细胞进行检测分析。免疫荧光法检测ATF-6a蛋白表达；RT-PCR检测细胞GRP78mRNA水平表达；免疫组化法检测Caspase-3蛋白表达。(2)统计方法：数据用均数±标准差(χs)表示,采用SPSS13.0统计软件进行进行数据处理,实验结果比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),以P<0.05作为差异有统计学意义的判定标准。三、结果(1)L02细胞过氧化损伤时ATF-6a蛋白的表达及丹酚酸A干预的影响过氧化损伤组ATF-6a在12h平均光密度值较0h及对照组明显升高,达峰值水平；至24h有所下降,但仍明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。丹酚酸A预处理组ATF-6α在12、24h平均光密度值均明显高于对照组(P<0.01)但较过氧化损伤组下降明显(P<0.01)；比较丹酚酸A预处理组12h与24h ATF-6a表达,12h虽略高于24h,但差异无统计学意义(P>0.05)。(2)L02细胞过氧化损伤时GRP78mRNA的表达及丹酚酸A干预的影响过氧化损伤组GRP78mRNA在12h表达较0h增强明显,至24h表达有所减弱,均明显高于同期对照组,差异均有统计学意义(P<0.01)。丹酚酸A预处理组GRP78mRNA表达12h较0h表达上升明显,强于对照组,但较过氧化损伤组下降明显(P<0.01),至24h时表达稍有回落,仍明显强于对照组(P<0.01),且弱于同期过氧化损伤组。丹酚酸预处理组12-24h回落幅度较小,低于过氧化损伤组。(3)L02细胞过氧化损伤时Caspase-3蛋白的表达及丹酚酸A干预的影响过氧化损伤组Caspase-3在12h平均光密度值较0h升高,明显强于对照组,持续至24h进一步升高,达峰值水平,与对照组差异有统计学意义(P<0.01)；丹酚酸A预处理组12h、24h平均光密度值明显强于对照组,但均低于过氧化损伤组(P<0.01)；相比较对于过氧化损伤组12h-24hCaspase-3表达上调,丹酚酸A预处理24h较12h表达反而略有减弱,但差异无统计学意义(P>0.05)四、结论H2O2可诱导L02细胞发生ERS,在0h至12h主要表现为ATF-6a活化,GRP78mRNA表达快速上调,增强自身蛋白折叠能力、促内质网稳态的恢复,至24h持续的过氧化损伤引起Caspase-3高表达可能与持续存在的ERS有关。丹酚酸A预处理可通过其抗氧化作用直接减轻氧化应激反应,并可下调ERS分子的过高表达,从而相对减弱过强的ERS,促进细胞内质网稳态的恢复,相对阻抑或减缓其向促细胞凋亡的转变,减少细胞死亡程序的活化,由此综合发挥细胞保护作用。其具体机制还有待进一步研究。