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第一部分:miR-196b、PCDH-17表达在人喉鳞状细胞癌中的差异性表达及与患者预后关联性分析目的:探究miR-196b、PCDH-17在人喉鳞状细胞癌及癌旁正常组织中的差异性表达,确定其促癌性或抑癌性,分析miR-196b、PCDH-17与患者预后关系。材料与方法:选取2010年6月到2013年6月在我院经病理诊断确诊为人喉鳞癌并且进行手术的79例患者癌组织及癌旁正常组织;患者的肿瘤淋巴结转移(TNM)分期按照国际癌症控制联盟(UICC)和美国癌症联合委员会(AJCC)共同制定的AJCC/UICC第8版头颈部肿瘤分期标准。统计79例患者的一般社会学资料、临床病理资料;免疫组织化学染色分析癌组织及癌旁组织中PCDH-17蛋白阳性表达;RT-PCR检测人喉鳞癌及癌旁组织中miR-196b、PCDH-17 m RNA浓度表达;确定miR-196b、PCDH-17 m RNA表达的相关性;对79例患者随访五年,统计患者生存率,miR-196b、PCDH-17 m RNA表达与患者预后关联性分析。结果:一般临床资料分析:患者的平均年龄为60.58±14.25岁;男性患者占据大多数比例;喉鳞癌患者伴随较高比例的吸烟史及酗酒史,组织学分级I级比例最低,II级和III级比例数据差异性较小;T1分期比较最低,T2~T4分期比例差异性较小;N0分期占据绝大多数比例,TNM的分期体现出相同的趋势,其中I期比例最低,II~IV期比例差异性较小;RT-PCR检测喉鳞癌及癌旁组织中miR-196b及PCDH-17的m RNA表达:喉鳞癌组织内miR-196b的表达要明显的高于癌旁正常组织,体现出明显促癌性特点;PCDH-17的表达要明显地低于癌旁正常组织,体现出抑癌性特点;两组数据相比,差异有显著统计学意义(P<0.05);免疫组织化学染色检测喉鳞癌及癌旁组织中PCDH-17蛋白阳性率表达:癌组织内PCDH-17蛋白的阳性表达率明显地低于癌旁正常组织,数据差异有显著统计学意义(P<0.05);miR-196b、PCDH-17表达与喉鳞癌患者临床病理特征相关性:不同年龄段、性别比例、吸烟史及酗酒史中miR-196b及PCDH-17的表达差异性较小,P>0.05,差异不具有统计学意义。随着组织学分级的增加、T分期及N分期的增加、TNM分期的增加,miR-196表达体现出增加趋势,PCDH-17表达体现出降低趋势,数据差异有显著统计学意义(P<0.05);miR-196b、PCDH-17 m RNA表达Pearson分析:随着癌组织内miR-196b表达的增加,PCDH-17的表达呈现出下降趋势,相关性系数r值为0.586,P<0.001,差异具有统计学意义;miR-196b、PCDH-17表达与喉鳞癌患者生存率相关性:在79例患者长达5年的随访过程中,发现最后有42例患者依然处于生存状态,其生存率为53.16%。将miR-196的m RNA表达中位数4.922作为截断值,miR-196高表达组患者在不同时间段内患者生存例数要低于miR-196低表达组患者,统计分析数据差异有统计学意义(P<0.05);PCDH-17的m RNA表达中位数0.228作为截断值,PCDH-17高表达组患者在不同时间段内患者生存例数要高于PCDH-17低表达组患者,统计分析数据差异有统计学意义(P<0.05)。结论:在喉鳞癌病理发展中,miR-196b体现出促癌性特点,PCDH-17体现出抑癌特点,二者表达呈现负相关性,且与喉鳞癌的临床组织学分级及TNM分期等体现相关性,给予下文研究提供基础。第二部分:miR-196b靶向PCDH-17调控人喉鳞状细胞癌进展机制研究目的:充分探讨喉鳞癌病理过程中miR-196b对PCDH-17的靶向调控性以及二者在喉鳞癌细胞生物活性中的调控作用。材料与方法:选取喉鳞癌Hep-2细胞系作为研究对象,原代培养,选取第三代单层细胞作为研究对象,细胞内转染miR-196b inhibitor、miR-NC、miR-196b mimic以及PCDH-17等,使其在喉鳞癌细胞Hep-2中过表达或者部分沉默,分别设置如下分组:Control组(癌细胞不做任何处理)、miR-196b inhibitors(癌细胞内miR-196b inhibitor部分沉默处理)、miR-NC(癌细胞内转染miR-196b空质粒)、PCDH-17(癌细胞内转染PCDH-17,使其在细胞内过表达)、miR-196b mimics+PCDH-17(癌细胞内转染miR-196b及PCDH-17,使其在细胞内过表达);细胞继续培养48小时后,进行相关项目验证分析:双荧光素酶基因检测miR-196b对PCDH-17的靶向调控作用;RT-PCR检测各组细胞内PCDH-17的m RNA表达,确定miR-196b对PCDH-17的靶向调控性;CCK-8检测各组细胞的增殖趋势;Annexin V法检测各组细胞凋亡性;划痕实验检测各组细胞迁移性;Transwell法检测各组细胞的侵袭性;Western-blotz检测各组细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭等相关蛋白浓度表达分析。结果:miR-196b靶向PCDH-17分析:我们采用Target Scan软件进行数据分析发现,miR-196b的m RNA 3’非编码区预测到一个PCDH-17结合位点,分别构建了miR-196b的荧光素酶野生型(wt-p GL3-miR-196b-3’UTR)和突变型报告基因载体(mut-p GL3-miR-196b-3’UTR),并通过共转染实验鉴定miR-196b与PCDH-17的结合能力。应用共转染技术将不同组合的野生型和突变型p GL3-miR-196b-UTR表达载体转染到Hep-2细胞中,结果表明共转染野生型表达载体报告基因活性相对于对照组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);在miR-196b的数据分析中,对照组、空白质粒组以及PCDH-17过表达组miR-196b表达差异性较小,差异不具有统计学意义;miR-196b部分沉默组数据明显降低,miR-196b过表达组数据明显提升,差异有统计学意义(P<0.05);在PCDH-17的数据分析中可以看出,对照组、空白质粒组以及二者共同表达组PCDH-17表达差异性小,分别与对照组数据相比,差异不具有统计学意义;而miR-196b受到抑制以及PCDH-17过表达后,PCDH-17的表达浓度均能明显提升,差异有统计学意义(P<0.05);CCK-8检测各组细胞增殖活性:随着时间的延长,各组细胞的增殖趋势均明显增加,当miR-196b受到抑制以及PCDH-17过表达后,细胞的增殖趋势增加幅度降低,对照组、空白质粒组以及miR-196a及PCDH-17均过表达组细胞的增殖趋势明显提升,数据差异有显著统计学意义(P<0.05);Annexin V法检测各组细胞凋亡性:当miR-196b受到抑制以及PCDH-17过表达后,细胞的凋亡趋势明显加强,细胞凋亡率分别为(13.20±1.17)%及(13.37±1.51)%,数据差异有统计学意义(P<0.05);对照组、空白质粒组以及miR-196a及PCDH-17均过表达组细胞的凋亡趋势差异性较小,分别为(5.61±0.75)%、(5.49±1.01)%及(5.37±1.51)%,各组数据同对照组相比,差异不具有统计学意义;划痕实验及Transwell实验:随着时间的延长,各组细胞均体现出一定的迁移、侵袭能力,当miR-196b受到抑制以及PCDH-17过表达后,细胞的迁移、侵袭能力明显降低,P>0.05,差异不具有统计学意义;而对照组、空白质粒组以及miR-196a及PCDH-17均过表达组细胞的迁移侵、袭能力明显提升,数据差异有统计学意义(P<0.05);Western-blot检测:miR-196b受到抑制以及PCDH-17过表达后,Survivin、Bcl-2、MMP-2及MMP-9蛋白表达浓度降低,Bax蛋白表达浓度提升,细胞的增殖、迁移、侵袭趋势明显降低,凋亡能力明显提升,数据差异有统计学意义(P<0.05);对照组、空白质粒组以及miR-196a及PCDH-17均过表达组细胞的Survivin、Bcl-2、MMP-2及MMP-9蛋白表达浓度提升,Bax蛋白表达浓度下降,增殖活性、迁移、侵袭能力明显提升,细胞的凋亡性降低,P>0.05,差异不具有统计学意义。结论:在喉鳞癌病理发展中,miR-196b负向靶向PCDH-17进而对喉鳞癌细胞的生理行为进行调控,miR-196b过表达可以明显抑制PCDH-17的表达,促进喉鳞癌细胞的增殖活性、迁移及侵袭能力,细胞凋亡性降低;miR-196b被抑制后后体现出相反的趋势,给予临床一定的启发。