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干扰素(Interferon，IFN)是由动物细胞产生的，具有抗病毒、抗肿瘤及免疫调节等作用的一类细胞因子。IFN分为I型、II型和新发现的III型，III型干扰素又称为IFN-λs，其氨基酸水平和蛋白质功能与I型相近。由于IFN-λs受体组织分布特异性，IFN-λs主要在呼吸道、消化道和皮肤黏膜组织以及上皮细胞或某些肿瘤细胞发挥抗病毒作用，与IFN-α相比，能够有效地降低毒副作用。在我国，奶牛病毒性传染病如口蹄疫（FMD）、牛病毒性腹泻病（BVD）和牛传染性鼻气管炎（IBR）等可通过消化道、呼吸道传播的疫病，至今危害仍比较严峻，因此牛IFN-λs成为继IFN-α和IFN-β后，抗病毒制剂研发的一个方向。为深入研究牛IFN-λs的抗病毒活性及其机制，揭示其用于防治牛病毒病的可行性，本研究利用毕赤酵母分泌表达系统表达了无冗余氨基酸的重组牛IFN-λ3，同时酵母分泌表达了重组牛IFN-α和IFN-β，大肠杆菌表达系统表达了重组牛IFN-β和IFN-γ，深入研究了各重组干扰素的抗病毒活性，比较了IFN-λ3与I型和II型干扰素单独或联合应用抗病毒活性的异同，主要研究内容如下：1.首先在毕赤酵母表达系统实现了无冗余氨基酸重组牛IFN-λ3的可溶性表达。参考酵母密码子使用偏好性，同时考虑自由能和二级结构等要素，将已知的牛IFN-λ3（boIFN-λ3）基因序列优化成适合酵母表达的最优序列，然后利用重叠延伸PCR技术将设计的相互重叠20bp左右的14条寡核苷酸融合，获得boIFN-λ3基因和及其等位基因命名为boIFN-λ3*（1个基因差异使得成熟肽第18位氨基酸不同）。通过酶切连接的方式，成功构建酵母分泌表达载体pPICZαA-boIFN-λ3和pPICZαA-boIFN-λ3*。在毕赤酵母表达系统中通过一系列的筛选鉴定，如阳性重组酵母菌的鉴定，高表达酵母菌株的筛选，诱导表达条件的优化等最终表达了重组boIFN-λ3和boIFN-λ3*蛋白，表达量均可达1.2g/L，均以糖基化蛋白（23kDa大小，占总蛋白70%左右）和非糖基化蛋白（18kDa大小，占总蛋白15%左右）2种形式表达。经硫酸铵盐析和阳离子交换层析获得了纯化蛋白，重组蛋白均具有良好的抗原性，同时制备了抗boIFN-λ3*多抗。在MDBK-VSV系统测定重组boIFN-λ3和boIFN-λ3*蛋白的生物学效价分别为2.39±0.15×10~6U/mg/ml和2.15±0.40×10~6U/mg/ml。理化特性方面，重组蛋白均对胰酶敏感，对热较为不敏感（63℃），对酸碱部分敏感（pH2活性下降2倍），可被特异性抗体中和。从重组蛋白的表达、纯化、糖基化分析、理化特性、生物学活性和致细胞毒性等综合分析，重组蛋白boIFN-λ3和boIFN-λ3*没有区别。2.表达纯化了重组牛IFN-α/IFN-β/IFN-γ并初步测定了它们的生物学活性。为比较重组boIFN-λ3与I型和II型IFN的抗病毒活性，酵母分泌表达系统表达了重组牛IFN-α和IFN-β，大肠杆菌系统表达纯化了重组牛IFN-β和IFN-γ，测定它们的生物学活性分别为1.50±0.98×10~7、1.25±0.38×10~4、2.44±0.91×10~3和0.81±0.21×10~5U/mg/ml。在MDBK-VSV系统中4种重组干扰素抗病毒效价大小排序为boIFN-α>boIFN-λ3> boIFN-γ>boIFN-β。在EBK和MDBK细胞上利用MTT法测定4种重组干扰素的细胞毒性，结果显示，重组boIFN-λ3和其他IFNs单独或联合应用致细胞毒性均较小。3.重组boIFN-λ3和boIFN-α/boIFN-β/boIFN-γ诱导Mx1蛋白和ISRE启动子活性的研究。经过Western blot检测重组boIFN-λ3在4种上皮细胞源细胞（EBK、BT、MDBK和BMEC）中均能够诱导产生Mx1蛋白。采用双荧光素酶报告基因系统，通过检测ISRE报告基因的表达水平来间接反映干扰素的生物活性。结果显示不同浓度的重组IFNs诱导启动子表达均呈一定程度的剂量依赖性，重组boIFN-λ3和boIFN-γ诱导报告基因的表达水平呈时间依赖性，48h达到较高水平；而boIFN-α和boIFN-β能够快速的诱导报告基因表达，干扰素作用12h即达到较高的水平，且维持到48h。联合应用时部分组合比单独应用时诱导ISRE活性高。因此各IFNs刺激产生的ISRE启动子活性的差异可能是重组boIFN-λ3与其他IFNs协同抗病毒活性的机理之一。4.比较研究了重组boIFN-λ3和重组boIFN-α/boIFN-β/boIFN-γ抗IBRV、FMDV和BVDV的研究。通过TCID50法测定抗IBRV和FMDV活性，抗cpBVDV采用噬斑减数法，抗ncpBVDV采用半定量RT-PCR法。结果显示重组boIFN-λ3和其他3种重组IFNs均具有抗IBRV和FMDV的活性，且呈一定程度的剂量和时间依赖性。其中抗FMDV活性较强，抗IBRV活性较弱。重组boIFN-λ3可条件性的抑制cpBVDV和ncpBVDV的增殖，即在先孵育干扰素后感染病毒时，重组boIFN-λ3可抑制BVDV增殖，反之则没有作用。5.重组boIFN-λ3和boIFN-α/boIFN-β/boIFN-γ协同抗病毒的研究。通过测定干扰素作用后的病毒-细胞混悬液的TCID50，结果显示重组boIFN-λ3抗IBRV时和boIFN-γ协同作用强，抗FMDV时，boIFN-λ3在EBK和BT细胞上均显示出和boIFN-α/boIFN-β明显的协同作用，提示在临床应用时可以联合应用重组boIFN-λ3和其他干扰素。推测协同机制可能与ISRE启动子活化水平及干扰素刺激基因（ISGs）的表达等有关。6. ncpBVDV持续性细胞感染是否影响重组boIFN-λ3抗病毒活性的研究。ncpBVDV（HLJ-11）感染MDBK细胞后在不同浓度重组boIFN-λ3和重组boIFN-α压力筛选下传代8次，通过半定量RT-PCR检测BVDV核酸，结果显示在干扰素压力下，病毒可以耐受干扰素，造成细胞持续性感染，而此种状态下的MDBK细胞仍能感染VSV，且不影响重组boIFN-λ3在此细胞上发挥抗VSV活性，因此这种细胞是耐受BVDV同时对IFN敏感的细胞。另一方面，ncpBVDV预先感染MDBK细胞不影响boIFN-λ3和其他IFNs在此细胞上发挥抗VSV和IBRV的作用。因此，牛IFN-λ3蛋白的研制及其与I型和II型干扰素抗病毒活性的深入比较研究为进一步了解牛IFN-λs的生物学功能提供了理论基础并为抗病毒制剂的制备提供了物质材料。