一.研究背景　　 帕金森病(Parkinson Disease,PD)足一种中老年人常见的中枢神经系统变性疾病，临床表现主要包括肌强直、运动障碍、静止震颤、姿势障碍等。主要病理改变为中脑黑质致密部多巴胺能神经元进行性变性、死亡，同时伴残存神经元内出现路易小体(Lewy's body)。目前常用的抗帕金森药物如左旋多巴、多巴胺受体激动剂等并不能阻止或减缓PD的病程，因而对多巴胺能神经元有神经保护作用的抗帕金森病药物成了研究的热点。白果内酯(bilobalide)——银杏叶提取物(extracts of Ginkgo biloba leaves，EGbs)中的主要成份，便是具有神经保护作用潜能的药物之一。　　 大量动物实验表明EGbs能减少海马区神经元的死亡，改善痴呆症状，并有至少四项随机双盲试验表明它能减轻阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)和血管性因素引起的痴呆。目前，EGbs是世界范围内应用最多的治疗痴呆的药物之一。白果内酯作为EGbs的主要有效成份，动物和离体实验证明它具有EGbs的几乎所有特性，包括保护线粒体功能、抗氧化应激、清除氧自由基、抗细胞水肿、抑制β-淀粉样蛋白的聚集和毒性等。　　 PD同样是最常见于老年人的神经退行性疾病之一，它和AD在发病机制，病理过程等方面均极相似。首先，两者都涉及蛋白质的异常折叠和沉积，在PD为α-共核蛋白(α-synuclein protein)和路易氏小体，在AD为β-淀粉样蛋白；两者均有大量神经元的非炎症性死亡，包括凋亡；两者均与氧化应激及氧自由基损伤、兴奋性氨基酸毒性、N-甲基-D-门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受体分布异常，溶酶体功能缺陷等密切相关。人们发现一些对AD有治疗作用的药物对例如NMDA受体拮抗剂美金刚(Memantine)和利福平对PD患者亦同样有效，也说明了两种疾病之间共享某些发病的机制。　　 AD和PD之间的相似性让人猜测白果内酯对PD和多巴胺能神经元也有保护作用。这一猜测已经得到了初步证实：动物实验表明，白果内酯能明显缩短大鼠由于腹腔注射毒扁豆碱所引起的震颤持续时间，同样，可明显减轻由微量6-羟多巴胺(6-OHDA)单侧黑质注射引起的PD大鼠模型的旋转。体外实验示它对一氧化氮(NO)、6-OHDA、1-甲基-4-苯基-吡啶盐(1-methyl-4-phenyl-pyridinium，MPP+)、鱼酮藤所致的细胞损害有保护作用，可能的机制包括有减轻保护线粒体功能、抗氧化应激、抗兴奋性毒性、抑制凋亡等。另外，白果内酯对β-淀粉样蛋白所致的PC12细胞凋亡有保护作用，提示其可能对蛋白质异常折叠及聚集有干预作用。a-Synuclein蛋白的过量或异常表达被认为是PD最重要的发病机制之一，但是白果内酯对a-Synuclein蛋白表达的影响尚未见报道。本课题在已有的实验基础上观察白果内酯对a-Synuclein蛋白转录和表达水平的影响，进一步探索白果内酯的可能的神经保护作用机制。　　 为了探讨白果内酯对PC12细胞的影响及可能的机制，我们选择鱼酮藤构建PD的细胞模型。用鱼藤酮制作PD动物模型及细胞模型的技术目前已比较成熟，与1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2，3,6-tetrahydropyridine，MPTP)一样，鱼藤酮是一种高亲和力的经典的线粒体复合物Ⅰ抑制剂，能引起神经元尤其是多巴胺能神经元的损伤和死亡，并产生在病理表现、临床症状上都极类似于人类PD疾病的动物模型。除了线粒体功能障碍、ATP合成减少、脂质过氧化和活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的过度生成外，鱼藤酮尚可干扰细胞内的微管系统，并增加α-synuclein蛋白的异常折叠和聚集，在免疫组织化学和免疫荧光染色中可观察到类圆形α-synuclein染色阳性的包涵体形成。本课题欲研究白果内酯对PC12细胞的保护作用，重点观察是否与氧化应激及α-synuclein蛋白的表达和聚集相关，故选用鱼藤酮构建细胞模型是合理的选择。　　 二.研究目的　　 1.建立鱼藤酮诱导的α-synuclein过量表达的PD细胞模型。　　 2.明确白果内酯对鱼藤酮处理的PC12细胞是否具有保护作用。　　 3.进一步了解白果内酯对α-synuclein蛋白的转录和表达是否有影响。　　 4.结合已有的实验成果，探讨PD发病机制中氧化应激和α-synuclein蛋白的关系，以及白果内酯发挥保护作用的可能机制，为其用于PD的临床治疗提供依据。　　 三.实验步骤和方法　　 1.细胞培养及分组：PC12细胞(大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株细胞)经100ng/ml7S神经生长因子处理9天成分化细胞后培养于含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基中，并5％CO2的37℃培养箱孵育，隔天更换培养基。根据不同的处理条件分成4组：对照组(常规加培养基)、鱼藤酮组、鱼藤酮+白果内酯(低，高剂量)预处理组。　　 2.确定细胞模型建立方法。在正常培养的PC12细胞中加入不同浓度梯度的鱼藤酮(50nmol/L-3.2μmol/L)，作用24h后，用MTT法检测细胞活性，根据结果确定鱼藤酮的作用浓度。　　 3.确定白果内酯的作用浓度。在正常培养的PC12细胞中加入不同浓度梯度的白果内酯，2小时后根据前一步骤的结果，加入一定浓度的鱼藤酮，作用24h后以MTT试验的结果选取用于后续实验的白果内酯的低、高剂量浓度。　　 4.明确白果内酯对鱼藤酮处理的分化PC12细胞是否具有保护作用。根据上述分组施以不同的处理并检测以下指标：(1)MTT法检测细胞活性；(2)普通光学显微镜观察细胞形态学改变；(3)荧光显微镜观察Hoechst33342核染色情况；(4)annexin V-FITC/PI染色，流式细胞仪检测细胞凋亡率。　　 5.用RT-PCR方法和Western-Blotting方法检测各组细胞α-synuclein mRNA和α-synuclein蛋白的量。　　 6.统计分析：数据以均数±标准差表示，应用SPSS16.0统计软件，采用单因素方差分析，处理组间的两两比较用LSD-t检验，P＜0.05认为有统计学意义。　　 四.实验结果　　 1.1.6μmol/L鱼藤酮作用24h能显著减低分化PC12细胞的细胞活性，表现为细胞肿胀变圆、崩解、轴突消失、细胞数量减少；MTT试验结果示鱼藤酮组细胞存活率显著下降(71.51％±2.83％)，10μmol/L及50μmol/L白果内酯组存活率分别为(80.73％±2.46％)、(87.58％±3.21％)、均显著高于鱼藤酮组(P＜0.01)，并能减轻鱼藤酮引起的形态学改变。　　 2.1.6μmol/L鱼藤酮作用24h引起PC12细胞凋亡增多，在Hoechst33342细胞核染色图片中表现为胞核边缘粗糙、核固缩、荧光增强，有的可见核碎片。Annexin V-FITC/PI染色，流式细胞仪检测示鱼藤酮组细胞凋亡率为15.2±1.8％，较control组显著增加，有统计学差异(P＜0.05)；低、高剂量白果内酯组(10、50μmol/L)凋亡率分别为9.3±1.4％，10.1±0.8％，两者间无统计学差异，但均显著低于鱼藤酮组(P＜0.05)。　　 3.Western-blotting结果示：鱼藤酮组α-synuclein蛋白的表达显著大于对照组，接近正常细胞的三倍，(P＜0.01)。低、高剂量白果内酯组α-synuclein蛋白的表达量显著低于鱼藤酮组(P＜0.01)，但仍高于正常对照组。　　 4.RT-PCR结果示：鱼藤酮组α-synuclein mRNA的量显著大于对照组(P＜0.05)；低、高剂量白果内酯α-synuclein蛋白的表达量显著低于鱼藤酮组(P＜0.01)，接近对照组水平。　　 五.实验结论　　 1.鱼藤酮可诱导出α-synuclein蛋白高表达的帕金森病细胞模型。　　 2.白果内酯能同时减轻鱼藤酮引起的PC12细胞的坏死和凋亡，对分化PC12细胞有保护作用。　　 3.白果内酯能抑制α-synuclein蛋白的表达及下调α-synuclein基因的转录，这可能是白果内酯发挥保护作用的重要机制。