针灸穴位对内脏具有调节作用,其作用机制一直是针灸基础研究中的重点。针刺穴位对内脏功能的调节属于“躯体-内脏”反射的范畴。在针刺对胃运动的调节中存在穴位特异性,以往的研究表明这与神经节段性支配和自主神经系统的调节相关,但其在中枢的调节机制尚不明确。刺激不同穴位产生特异性的靶器官效应,这其中必有其相应的神经生物学调节机制。阐明这些调节机制,将对针灸临床选穴奠定科学基础。躯体与内脏联系的外周机制是轴突反射。在以往的研究中,对穴位与内脏的联系较为常见的解释是神经节段学说。该学说很好的解释了近节段的俞募穴与对应内脏疾病之间产生疗效的神经生物学基础,但对于远节段的下肢穴位(如足三里穴),其治疗作用与中枢神经系统的功能完整性有关。内脏感觉和穴位的传入信息到达延髓后进行整合,通过自主神经的下行传导通路对内脏活动进行调节。目前的研究认为孤束核(nucleus of solitary tract, NTS)和迷走神经背核(dorsal motor nucleus of vagus, DMV)是接受内脏感觉投射和调节胃运动的最基本的核团。足三里是足阳明胃经要穴；中脘是胃的募穴、八会穴的腑会、足阳明胃经与任脉交会穴。这两个穴位作为治疗胃脏疾病的穴位,应用非常广泛。以往的研究表明针刺足三里通过激活迷走神经引起胃运动的增强,而针刺中脘则通过同节段的交感神经的作用引起胃运动的抑制。足三里和中脘穴对胃运动的不同调节效应在延髓可能与NTS和DMV中的胃内脏感觉及运动相关的神经元密切相关。神经元被刺激激活的一种标志是c-fos表达,可用其分析中枢神经系统的神经元受到外周刺激后的活动变化。本研究采用稀盐酸(HCl)造成胃黏膜损伤模型,从形态学、电生理学的角度观察电针刺激足三里穴或中脘穴对胃黏膜损伤大鼠延髓c-fos的表达、胃电活动的变化以及其对NTS与DMV神经元放电的影响,揭示电针对胃内脏感觉和内脏运动影响的中枢机制,为针刺作用机制提供科学依据。1实验目的1胃黏膜损伤对大鼠胸髓背角和延髓NTS神经元c-fos表达的影响及针刺对其的作用。采用免疫组织化学的研究方法,明确胃黏膜损伤所产生的原癌基因c-fos在胸髓背角和延髓NTS中的表达,为下一步电生理学研究明确胞外放电的记录位置。在此基础上观察电针刺激不同穴位对这些部位的神经元c-fos表达的影响。2观察电针足三里、中脘穴对胃黏膜损伤大鼠胃电(electrogastrogram, EGG)活动、延髓NTS和DMV神经元的胞外放电的影响。采用多通道阵列电极技术,记录大鼠延髓NTS和DMV神经元的胞外放电并同步观察胃黏膜损伤刺激信息、胃运动以及电针刺激不同穴位在延髓内脏感觉和内脏运动中枢的加工和整合,明确电针足三里和中脘穴对胃内脏感觉和内脏运动影响的中枢机制。2动物及实验方法选用正常成年无特定病原菌(SPF, specific pathogen free)级Sprague-Dawle大鼠66只,雄性,200-250g,由中国医学科学院提供。实验前禁食24小时以排空胃内食物,并饲以5%葡萄糖水。用于形态学实验的动物为16只,实验动物随机分为4组：生理盐水对照组(按1ml/100g体重剂量,经胃导管导入生理盐水)、胃黏膜损伤模型组(按lml/100g体重剂量,经胃导管导入0.5mol/L的HCl)、胃黏膜损伤模型+电针足三里组、胃黏膜损伤模型+电针中脘组。生理盐水对照组和胃黏膜损伤模型组在完成灌胃后45min进行灌流固定；胃黏膜损伤模型+电针组采用频率为15Hz,刺激强度2mA的电针刺激,在HCl灌胃10min后电针干预30min,于灌胃后45min进行灌流固定。取脊髓胸段(T8-12)和延髓段,样本经后固定脱水处理后,进行冰冻切片,使用免疫荧光染色的方法观察c-fos阳性神经元在胸髓背角和延髓NTS核团中的表达。用于电生理学实验的动物为50只,随机分为5组：电针足三里组、电针中脘组、胃黏膜损伤模型组(按lml/100g体重剂量,经胃导管导入0.5mol/L的HCl)、胃黏膜损伤模型+电针足三里组、胃黏膜损伤模型+电针中脘组。通过手术在大鼠胃浆膜层放置胃电记录电极,选择在延髓c-fos表达密集的NTS区域放置多通道阵列电极,同步记录胃电和延髓不同核团神经元胞外放电,通过观察正常生理状态下电针前后胃电指标：胃平滑肌细胞放电(gastric myoelectrical activity, GMA)的频率(簇/分,cluster per minute)和胃电慢波(gastric slow wave, GSW)的积分(mV·sec)的改变,胃黏膜损伤前后胃电和神经元放电频率的改变以及胃黏膜损伤后电针足三里或中脘穴干预前后胃电和神经元放电频率的改变,观察分析电针足三里或中脘穴在胃黏膜损伤模型中对胃内脏感觉和内脏运动核团的作用机制。3结果3.1急性胃黏膜损伤大鼠胸髓背角和延髓NTS神经元c-fos表达的影响及电针足三里、中脘的作用3.1.1急性胃黏膜损伤对大鼠脊髓背角神经元c-fos表达的影响胃黏膜损伤模型组在T10节段脊髓背角中c-fos免疫阳性反应神经元主要分布在Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ板层,可以看到呈深染的细胞核,胞浆也有染色。急性胃黏膜损伤对大鼠胸髓节段背角神经元的c-fos表达没有显著影响(P>0.05,n=4)。3.1.2急性胃黏膜损伤对延髓NTS区神经元c-fos表达的影响及电针足三里、中脘的作用急性胃黏膜损伤后,c-fos免疫阳性反应神经元NTS联合核和内侧亚核出现,其中在联合核和内侧亚核尾端密集表达,在联合核和内侧亚核头端少量表达。而急性胃黏膜损伤导致延髓NTS中内侧亚核尾端c-fos免疫阳性反应的神经元较生理盐水组相比明显增多(P<0.01,n=4)。电针足三里、中脘穴均可减少延髓NTS区急性胃黏膜损伤所产生c-fos表达,电针足三里穴的所产生的效应明显优于电针中脘穴(P<0.05,n=4)。3.2电针足三里、中脘穴对大鼠胃电的影响电针足三里穴后,正常大鼠GMA频率明显增加(P<0.05, n=7), GSW积分明显增加(P<0.05,n=9)。说明电针足三里穴可以显著增强胃运动。电针中脘穴后,正常大鼠GMA频率为明显减少(P<0.05, n=7), GSW积分明显减少(P<0.05,n=10)。说明电针中脘穴对胃运动有明显的抑制效应。3.3急性胃黏膜损伤对大鼠胃电、NTS和DMV神经元放电的影响及电针足三里、中脘的作用3.3.1急性胃黏膜损伤对大鼠胃电的影响及电针足三里、中脘的作用在急性胃黏膜损伤90s后大鼠GMA频率较损伤明显增多(P<0.01,n=7)；其GSW积分明显增大(P<0.01,n=7)。急性胃黏膜损伤5min后大鼠GMA频率明显减少(P<0.01,n=7)；GSW积分显著增大(P<0.05,n=7)。急性胃黏膜损伤30min后大鼠GMA频率明显减少(P>0.05, n=7); GSW积分相比无显著差异。说明急性胃黏膜损伤可以导致胃运动的显著增强且持续约30min。急性胃黏膜损伤可以引起胃运动的增强,而电针可以抑制这种伤害性增强。在损伤10mmin后,电针足三里后GSW积分较电针前明显减少(P<0.05,n=10)而在损伤10mmin后,电针中脘穴后GSW积分较电针前也明显减少(P<0.05,n=10)。说明电针足三里或中脘对急性胃黏膜损伤导致的胃运动的增强有抑制作用,且两个穴位的抑制作用无差异。3.3.2急性胃黏膜损伤对大鼠NTS神经元放电的影响及电针足三里、中脘的作用实验共记录到NTS中对急性胃黏膜损伤有反应的神经元细胞(前后放电频率变化率超过30%的细胞)61个,其中兴奋性神经元54个(占88.5%),对抑制性神经元7个(占11.5%)。NTS中存在对胃黏膜损伤兴奋的神经元,在胃黏膜损伤1min后和5min后其放电频率均显著增多(P<0.01,n=54)；急性胃黏膜损伤47min后其放电频率与损伤前相比无差异(P>0.05,n=54)。说明急性胃黏膜损伤可以导致NTS神经元放电的改变,而且这种伤害性刺激持续一段时间后恢复。电针足三里或中脘穴均可抑制急性胃黏膜损伤大鼠NTS中兴奋性神经元放电活动。急性胃黏膜损伤10min后,电针足三里穴,NTS兴奋性神经元放电频率与电针前相比明显减少(P<0.05,n=46)；电针中脘穴,NTS兴奋性神经元放电频率与电针前相比明显减少,(P<0.05,n=33)。电针足三里对NTS兴奋性神经元放电的抑制率为67.64±4.11%,电针中脘对NTS兴奋性神经元放电的抑制率为48.47±3.43%,说明足三里的抑制作用显著优于中脘(P<0.05)。3.3.3急性胃黏膜损伤对大鼠DMV神经元自发放电的影响及电针足三里、中脘的作用实验共记录到DMV中对急性胃黏膜损伤的反应即损伤前后放电频率变化率均不超过30%,因此不能其改变没有生理学意义。4结论1.0.5mol/L的盐酸造成胃黏膜损伤导致延髓NTS的联合核和内侧亚核c-fos阳性神经元表达显著增加,电针足三里穴可以抑制NTS神经元中c-fos蛋白的表达,且抑制作用明显优于电针中脘穴。2.急性胃黏膜损伤的伤害性刺激所产生反应的持续时间大约为30min,在此期’间胃运动和延髓NTS神经元的的电活动明显增强。而电针足三里穴和中脘穴都能抑制急性胃黏膜损伤导致的NTS兴奋性神经元放电活动的增强,电针足三里穴的效应同样优于电针中脘穴。