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心脏左右不对称畸形影响着人们的生活品质,甚至导致死亡。目前对心脏左右不对称发育过程牵涉到的分子机制仍不清楚,因此,研究调控心脏左右不对称发育候选基因的功能及其作用的分子机制具有重要的理论与临床应用意义。本文首先利用斑马鱼模型研究Had31基因在心脏左右不对称发育中的作用。我们检测了Had31在斑马鱼胚胎发育中的时空表达谱,研究结果显示,在胚胎发育到14体节期,Had31在左侧心脏原基的表达明显强于右侧的表达;而当胚胎发育到16体节期,Had31在右侧心脏原基的表达明显强于左侧的表达;当胚胎发育到17体节期,Had31在心脏两侧原基的表达量趋于一致,提示Had31与心脏左右不对称发育相关。本实验室前期建立了Had31敲除品系,我们通过对其后代分析发现,杂合子双亲繁衍的Had31纯合子胚胎出现围心腔肿大、心脏不能正常环化的表型,纯合子双亲交配产的卵不能发育。用心肌标记Myl7和左右不对称发育标记Spaw,Lefty2,Foxa3与Trypsin的实验也显示心脏不能正常环化。因Had31纯合子不育,我们改用吗啉代寡核苷酸（morpholino oligonucleotides,MOs）敲减Had31的表达进行研究。我们首先利用Had31-GFP质粒在胚胎中的表达分析Had31-MO敲减的Had31-绿色荧光蛋白的表达效率,结果表明Had31-MOs敲减是有效的。我们接着对Had31杂合子双亲繁衍的敲除纯合子胚胎与Had31-MOs敲减胚胎进行突变表型的对比分析,实验结果表明,两者出现相似的围心腔肿大,心脏不能正常环化的表型;用心脏左右不对称发育标记探针进行的胚胎原位杂交结果也获得相似的结果。文献报道,心脏环化的异常可能与早期心脏前体细胞的迁移有关。我们用Myl7为探针检测敲减Had31表达对心肌早期细胞迁移的影响。研究结果表明,Had31导致的心脏环化异常可能与早期心脏前体细胞的迁移有关。Had31在两侧的心脏原基中都有表达,提示Had31可能在中线左右两侧分别调控心脏左右不对称发育。已知位于中线左侧的Nodal-Pitx2信号调控心脏左右不对称发育。跨膜蛋白Nomo是Nodal的拮抗因子。我们通过胚胎原位杂交实验验证了 Nomo对Nodal/Spaw表达的抑制作用。基于本室早期研究发现定位于细胞核和细胞质中的Had31和Nomo存在相互作用,我们假设,在中线左侧信号中,ad31位于Nodal/Spaw信号中Nomo的下游。为了证明该假设,我们通过敲减或增强Nodal/Spaw或Nomo分析Had31的表达,实验结果显示Nodal/Spaw激活Had31的表达。因Nomo是Nodal/Spaw的拮抗因子,预期敲减Nomo应上调Had31在心脏原基左右两侧的表达,而过表达Nomo应下调Had31在心脏原基左右两侧的表达,我们通过胚胎原位杂交获得的结果与预期结果相符,即Nomo在中线两侧都抑制Had31的表达。这些实验结果表明,Had31位于斑马鱼胚胎左侧Nodal信号通路的下游。已知Nodal信号的下游成员Pitx2是成对同源域转录因子,那么,Had31与Pitx2的上下游关系是什么呢?我们进一步的实验结果显示Had31激活Pitx2的表达,提示Pitx2可能位于Had31的下游。如果该推论正确,过表达Pitx2应能拯救Had31的突变表型。我们通过过表达Pitx2证明其确实能够拯救敲减Had31导致的心脏环化异常畸形,表明Had31位于Pitx2的上游。通过上述实验已知Had31激活Pitx2的表达,Nodal/Spaw激活Had31的表达,故预期敲减Nodal/Spaw应下调Pitx2的表达,而过表达Nodal/Spaw应上调Pitx2的表达,我们的胚胎原位杂交结果与预期结果相符。因Had31激活Pitx2的表达,Nomo抑制Had31的表达,故预期敲减Nomo应上调Pitx2的表达,而过表达Nomo应下调Pitx2的表达。我们的胚胎原位杂交结果与预期结果相符。综上所述,我们的研究结果初步表明,Had31是中线左侧信号的新成员,构成Nodal-Had31-Pitx2信号调控心脏左右不对称的发育。最近的研究表明,位于背中线右侧的BMP4-Prrx1a信号调控心脏左右不对称发育。我们假设,在中线右侧信号中,Had31位于BMP4信号的下游。为了证明该假设,我们通过抑制或增强BMP4的表达分析其对Had31表达的影响。胚胎原位杂交实验结果显示BMP4抑制Had31在右侧心脏原基中的表达。已知Prrx1a属成对同源域转录因子,是BMP4-Prrx1a信号轴的下游基因,BMP4激活Prrx1a的表达。那么,Had31与Prrx1a的上下游关系是什么呢?我们的实验结果显示Had31抑制Prrx1a的表达,提示Prrx1a可能位于Had31的下游。我们通过敲减Prrx1a证明其确实能够拯救敲减Had31导致的心脏环化异常畸形,表明Had31位于Prrx1a的上游。我们的上述研究结果表明,Nomo抑制Had31的表达,而Had31抑制Prrx1a的表达,故预期敲减Nomo应下调Prrx1a的表达,而过表达Nomo应上调Prrx1a的表达,我们的胚胎原位杂交结果与预期结果相符。综上所述,Had31可能是BMP4-Prrx1a信号的新成员,可能在背中线右侧通过BMP4-Had31-Prrx1a信号轴调控心脏左右不对称发育。心脏房室瓣膜是心脏器官的一个重要组成结构,已知很多先天性心脏病都伴随着瓣膜缺陷。目前对心脏瓣膜发育过程中牵涉到的分子机制所知有限。本项目进一步研究了Had31和fhl1A基因对斑马鱼瓣膜发育的影响。首先我们研究Had31基因对斑马鱼瓣膜发育的影响。斑马鱼发育52 hpf胚胎进行的原位杂交分析结果显示,Had31敲除纯合子胚胎中的探针Versican和Has2的表达上调;而探针Tbx2b,Notch1b和BMP4的表达不变。这些结果初步说明Had31对斑马鱼心脏瓣膜的发育也存在调控作用。本博士论文研究的另外一个基因为fhl1A。我们课题组早期研究结果显示fhl1A在心脏腔室、心脏房室交界处和骨骼肌中表达。我们利用实验室建立的fhl1A敲除纯合子研究了fhl1A对心脏瓣膜发育的影响。研究结果表明fhl1A纯合敲除品系瓣膜标记基因Versican和BMP4的表达下调,Has2的表达增强。这些结果说明fhl1A确实调控瓣膜的发育。