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家蚕是具有代表性的泌丝节肢动物,是被人工驯化的经济昆虫。蚕丝作为一种天然的高分子生物材料,其力学性能优良,且具有可再生、可降解等优点。除了被广泛地应用于传统的纺织服装工业,还被加工应用于医疗卫生、美容、光电传导、纳米材料等新兴产业,因此蚕丝在纤维复合型材料领域有着广阔的应用前景。蚕丝蛋白是由家蚕特化的组织丝腺合成并分泌的。后部丝腺分泌的丝素蛋白和中部丝腺分泌的丝胶蛋白构成的丝蛋白溶液经吐丝管道作用由喷丝口喷出,形成固态纤维。家蚕吐丝管道主要由前部丝腺与吐丝器（及其附属腺体菲氏腺）组成,是蚕丝蛋白构象转变和蚕丝纤维化的主要场所。迄今为止,研究者广泛认为,蚕丝蛋白纤维化与金属离子、p H及剪切力有关。液体丝蛋白进入纺丝管道,由于从中部丝腺到前部丝腺管腔直径急剧变小,丝蛋白在剪切应力作用下聚集、自组装,二级结构从无规卷曲与螺旋构象向β-折叠构象转变,由液态转化为液晶态。进一步,在纺丝管道适宜的p H梯度与金属离子强度下,丝蛋白中的晶体沿纤维轴方向排布。最后家蚕通过头部摆动将丝蛋白拉出吐丝器,形成固态丝纤维。几丁质是自然界中除纤维素外含量最为丰富的多糖,是昆虫外骨骼和围食膜的主要成分。它与不同种类的表皮蛋白和围食膜基质蛋白结合形成复杂的结构,从而在不同组织发挥不同的生物学功能,因此几丁质与蛋白质的相互作用对节肢动物的生长发育至关重要。前部丝腺作为蚕丝纤维化的重要场所,有研究者通过转录组学、蛋白质组学及代谢组学的方法对吐丝管道的组成进行了分析鉴定。研究表明家蚕的前部丝腺中也存在大量表皮蛋白和几丁质,但其存在的生物学意义尚不明确。鉴于此,本研究以家蚕前部丝腺特异表皮蛋白ASSCP1和ASSCP2为靶标进行研究,通过原核表达的方式对其几丁质结合机制进行探究,采用转基因干涉的方法研究其在蚕丝成纤过程中的功能;同时通过转基因的方式对其在前部丝腺组织特异表达的机制进行探究。获得的主要研究结果如下:1、Bm ASSCP1与几丁质结合的机制研究生物信息学分析发现ASSCP1和ASSCP2均含有保守的R&R结构域及芳香族氨基酸。根据保守的芳香族氨基酸位点设计定点突变引物,构建重组表达载体。通过原核表达及镍柱亲和层析获得可溶形式的重组蛋白及重组突变蛋白。将重组蛋白和重组突变蛋白进行几丁质结合实验,结果发现,将R&R结构域中的芳香族氨基酸突变后,蛋白与几丁质结合能力减弱,表明ASSCP1中的芳香族氨基酸与其几丁质结合能力密切相关。2、Bm ASSCP1和Bm ASSCP2在蚕丝成纤过程中的功能研究对上簇期前部丝腺进行观察并统计内膜厚度。结果发现,前部丝腺在吐丝期维持稳定的形态,内膜厚度也基本不变。随着吐丝结束进入预蛹期,前部丝腺内膜开始降解,细胞出现凋亡形态。免疫荧光结果表明,ASSCP1与几丁质共定位于前部丝腺内膜层,在整个吐丝期稳定存在,并随着丝腺的变态发育而消失。为了探究ASSCP1与ASSCP2在蚕丝成纤过程中的功能,我们获得了ASSCP1-IR与ASSCP2-IR转基因干涉品系家蚕。研究发现转基因品系家蚕中ASSCP1与ASSCP2表达量的降低均会使内膜变薄。通过透射电镜观察发现,其会影响内膜结构的完整性及几丁质的排布。通过拉伸测试探究干涉ASSCP1与ASSCP2对蚕丝力学性能的影响,结果发现干涉ASSCP1与ASSCP2后,蚕丝力学性能变差,延展性与韧性显著降低,表明其可能参与丝纤维的形成,调控蚕丝力学性能。对前部丝腺进行观察发现,干涉ASSCP1使前部丝腺细胞变小,从而产生长度变短的表型。对上簇期ASSCP1-IR家蚕进行比较蛋白质组学分析发现,干涉ASSCP1会影响其他表皮蛋白的表达,暗示表皮蛋白间可能存在相互作用,共同参与内膜的构建。3、Bm ASSCP2的表达调控研究通过转基因的方式对ASSCP2的表达调控进行研究,探究其在前部丝腺特异表达的调控机制。首先将启动子顺次截短后与报告基因EGFP连接,构建转基因载体,显微注射后筛选阳性个体,共筛选到Bm CP2P（全长）、Bm CP2PT1108、Bm CP2PT757、Bm CP2PT448、Bm CP2PT357、Bm CP2PT257、Bm CP2PT157七个品系。通过荧光观察及Western blot的方式检测报告基因表达情况,结果发现,ASSCP2启动子Bm CP2P可启动外源基因EGFP在前部丝腺特异表达,当启动子截短至357 bp时仍具有前部丝腺特异活性,当截短至257 bp或157 bp时则失去活性,这表明在基因上游-357～-257 bp存在转录激活相关转录因子结合位点。EMSA实验表明,前部丝腺存在组织特异转录因子可与-357～-257 bp探针特异结合。我们通过数据库筛选到一个前部丝腺特异表达的转录因子Bm Sox2,其重组蛋白也可与-357～-257 bp探针特异结合,表明其可能参与了ASSCP2的组织特异性表达调控。综上所述,本研究通过转基因干涉的方法对ASSCP1与ASSCP2的功能进行研究,发现其可与几丁质相互作用,参与蚕丝纤维化,调控蚕丝力学性能,为蚕丝力学性能改造提供新的靶标;对ASSCP2在前部丝腺特异表达机制进行探究,发现其上游357 bp的启动子即具有前部丝腺特异活性,-357～-257 bp与转录激活相关,并筛选到前部丝腺特异转录因子Bm Sox2,为深入探究前部丝腺组织特异表达机制提供参考。