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研究背景宫颈癌作为女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,对女性的健康造成了很大的危害。宫颈癌的恶性程度和发病率位居女性肿瘤第2位,病死率达第5位。宫颈癌晚期易发生侵袭与转移是患者死亡的主要因素。而且它的发生是一个集多因素和多种机制参与的复杂过程。因而加强对于宫颈癌的侵袭转移机制的研究,这对于提高宫颈癌的预后有着重大的意义。研究表明,宫颈癌并不是单一因素引起,而是多个因素共同作用所导致的,这些因素包括了比如:社会因素、物理因素、遗传易感性因素、生物因素等等。长链非编码RNA(Long noncoding RNA,lncRNA)是一类新被发现的非编码RNA,lncRNA在肿瘤中的异常表达以及肿瘤发生发展的作用机制越来越受到研究者的关注。它通过调控microRNA的表达,在不同的疾病中发挥着不同的作用。初始miRNA(microRNA)由特定的核糖核酸酶剪切形成成熟miRNA,成熟miRNA可通过与靶基因信使RNA的3’非翻译区(3’UTR)结合,对靶基因进行转录及转录后调控,影响各种生物的生长发育以及细胞分化、增殖、侵袭迁移及凋亡等等过程。我们的前期研究表明miR-630在宫颈癌组织中低表达。继续研究发现,LncRNA NOC2L-4:1在宫颈癌中表达异常,并可以靶向调控miR-630的表达。为此,我们想明确LncRNA NOC2L-4:1在分子水平上对宫颈癌细胞中发生的生物学行为以及和miR-630在宫颈癌的体内外病理过程中发生的关系。并进一步研究miR-630的下游靶标,明确miR-630调控宫颈癌发生发展过程中的分子机制。第一部分Lnc RNA NOC2L-4:1调控miR-630的表达促进宫颈癌细胞的增殖与迁移目的:LncRNA NOC2L-4:1调控miR-630的表达促进宫颈癌细胞的增殖与迁移。方法:1.在正常的宫颈细胞及宫颈癌细胞中提取总RNA,qRT-PCR方法检测LncRNA NOC2L-4:1以及miR-630的相对表达量。2.利用293T细胞,通过荧光素酶报告基因系统检测LncRNA NOC2L-4:1与miR-630的结合调控关系。3.通过在LncRNA NOC2L-4:1表达较高的宫颈癌细胞系HeLa及SW756中分别转染siNC、siNOC2L-4.1以及siNOC2L-4.1+miR-630 inhibitor,qRT-PCR检测LncRNA NOC2L-4:1及miR-630相对表达量,CCK-8、平板克隆及transwell检测各组宫颈癌细胞的增殖及迁移能力。结果:1.qRT-PCR结果表明对比正常宫颈细胞,宫颈癌细胞中LncRNA NOC2L-4:1表达量明显增高,miR-630表达量明显降低。其中HeLa及SW756最为明显。对比NC组,siNOC2L-4.1组的HeLa及SW756细胞中LncRNA NOC2L-4:1的表达量减低,miR-630的表达量增高;siNOC2L-4.1+miR-630 inhibitor组对比siNOC2L-4.1组,LncRNA NOC2L-4:1的表达量无明显变化,miR-630表达量减低。2.生物信息学方法分析出LncRNA NOC2L-4:1调控miR-630结合位点,荧光素报告实验载体pGL3-Basic。对比野生型LncRNA NOC2L-4:1,转染突变型LncRNA NOC2L-4:1的质粒荧光素酶活性明显增强。3.对比siNC组,转染siNOC2L-4.1组的HeLa及SW756细胞的增殖及迁移能力减弱。但是转染siNOC2L-4.1+miR-630 inhibitor组细胞可部分恢复siNOC2L-4.1组的细胞增殖及迁移能力。结论:1.宫颈癌细胞系中,中LncRNA NOC2L-4:1高表达,miR-630低表达,两者之间存在靶向调控关系。2.LncRNA NOC2L-4:1促进宫颈癌细胞的增殖、迁移能力,机制上靶向调控miR-630发挥功能。第二部分:miR-630调控YAP1的表达在宫颈癌细胞中发挥作用目的:miR-630调控YAP1的表达抑制宫颈癌细胞的增殖与迁移能力。方法:1.通过生物信息学分析miR-630下游调控YAP1。2.利用293T细胞,通过荧光素酶报告基因系统检测miR-630与YAP1的结合调控。3.在宫颈癌细胞系HeLa及SW756中分别转染NC mimics、miR-630 mimics以及miR-630 mimics+YAP1过表达质粒,qRT-PCR检测miR-630及YAP1相对表达量,Western Blot检测YAP1相对表达量。细胞功能实验CCK-8、平板克隆及transwell来检测宫颈癌细胞的增殖及迁移能力。结果:1.c生物信息学方法分析出miR-630调控YAP1结合位点,荧光素报告实验载体pGL3-Basic。较转染野生型YAP1,转染突变型YAP1的质粒荧光素酶活性明显增强。2.对比siNC组,miR-630 mimics组的HeLa及SW756细胞中miR-630的表达量增高,YAP1表达量减低;miR-630 mimics+YAP1过表达质粒组对比miR-630 mimics组,miR-630的表达量无明显变化,YAP1表达量增高。3.对比siNC组,转染miR-630 mimics组的HeLa及SW756细胞的增殖及迁移能力减弱,但是转染miR-630 mimics+YAP1过表达质粒组细胞可部分恢复miR-630 mimics组的细胞增殖及迁移能力。结论:1.miR-630在宫颈癌细胞中低表达,并且靶向调控YAP1在宫颈癌细胞中的表达。2.过表达miR-630可抑制YAP1的表达,抑制宫颈癌细胞的增殖和迁移能力。第三部分:LncRNA NOC2L-4:1调控miR-630/YAP1通路在宫颈癌进展中发挥作用目的:体内实验验证LncRNA NOC2L-4:1调控miR-630/YAP1通路在宫颈癌进展中发挥肿瘤致癌基因的作用方法:1.构建敲减LncRNA NOC2L-4:1稳转慢病毒。转染HeLa细胞。尾静脉注射进行裸鼠成瘤实验。检测肿瘤生长体积及质量。2.qRT-PCR检测miR-630及YAP1相对表达量,Western Blot检测YAP1相对表达量。结果:1.对比NC组,敲减LncRNA NOC2L-4:1组裸鼠肿瘤体检增长缓慢,肿瘤质量减轻。2.对比NC组,敲减LncRNA NOC2L-4:1组裸鼠肿瘤中,miR-630表达量增高,YAP1表达量减低。结论:敲减LncRNA NOC2L-4:1可抑制肿瘤生长,LncRNA NOC2L-4:1可调控miR-630/YAP1轴。