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太谷核不育小麦是我国发现的一个由显性基因Ms2控制的雄性不育突变体。它在轮回选择和群体改良等方面得到了广泛的应用。雄性不育相关基因的克隆有助于了解Ms2基因的作用机制,这无论对基础研究还是应用研究都具有十分重要的意义。 本研究以Ms2近等基因系的可育小穗cDNA作为Driver,以不育小穗cDNA作为Tester进行缩减杂交(SSH),将扩增后的缩减杂交产物进行克隆,构建了一个包含883个重组克隆的SSH文库。分别以可育小穗和不育小穗的cDNA为探针对SSH文库进行差异筛选,结果显示80%以上的SSH克隆在不育系中呈上调表达。 在根据插入片段酶切指纹图谱对SSH文库中的414个阳性克隆进行分类的基础上,从12个出现频率较高的类型中各选一个克隆测序。BLAST分析表明这12个克隆中有11个与来源于穗部或减数分裂时期的花药cDNA同源。其中s90与来源于动物、植物和真菌的线粒体外膜移位酶(TOM,translocase of outer membrane)亚基TOM7同源,s106为小麦组蛋白H3的一部分,s210与豌豆休眠相关蛋白基因及杏、烟草等植物的生长素抑制蛋白基因同源,s214为小麦蔗糖:果糖6-果糖转移酶基因的一部分,s598为DNA拓扑异构酶的一部分。 上述12个克隆在小麦、簇毛麦、水稻和玉米基因组中均为单拷贝或寡拷贝基因。中国春缺体-四体材料分析表明s36和s90位于第三同源群,s210位于第五同源群,s211、s271、s294和s598位于第六同源群。以s36、s90、s210和s211为探针分别与不同组织和器官总RNA的点杂交表明它们在不育植株的茎杆、小穗和花药等组织中的表达量高于可育植株的相应组织。在其它组织中则没有表现出明显差异。 利用RACE-PCR和RT-PCR的方法,我们克隆了小麦TOM7类似蛋白基因的全长cDNA,并将该基因定名为Ttom7。对来自不同物种的TOM7亚基氨基酸序列的比较分析表明其疏水区保守性很高,其它部分则变异很大。 为了建立小麦雄性不育EST库和进行相关基因的筛选,我们构建了一个包含150,000个克隆的太谷核不育小麦幼小穗cDNAλ噬菌体文库。文库的重组率为98%,平均插入片段为1.2kb。以s36、s211、s271为探针筛选cDNA文库,获得了这些克------.木谷核不育小麦雄性不育相关基因的克隆研究_隆的同源基因.536的同源序列是一个全长的cDNA,编码一个307个氮基酸的蛋白质,与水稻的一个表达蛋白同源.5271的同源序列的编码区不完整,所编码的多肤与拟南芥一个未知蛋白同源.有趣的是1324bP的sZn同源序列具有cDNA的特征,但没有象样的开放读码框,可能是一个非编码的RNA基因. 在文库筛选过程中,还获得了拟南芥、水稻和油菜花药专化蛋白的小麦同源基因几sP,DNA损伤修复蛋白RAD”类似基因EST和一个磷诱导蛋白类似基因.前两个墓因被定位于小麦第七同源染色体群.