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研究背景和目的内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPC)作为血管内皮前体细胞,不仅参与人胚胎血管生成,同时也参与出生后血管新生和内皮损伤后的修复过程,并在内皮功能障碍相关性疾病的发生、发展中扮演重要角色,尤其是冠心病(coronary heart disease,CHD)和特发性肺动脉高压(idiopathic pulmonary hypertension, IPH)。对于内皮功能障碍相关性疾病,移植高增殖活性的EPC可能是一种具有应用前景的治疗方法。Assmus等直接将体外扩增后自体内皮祖细胞应用于临床治疗急性心肌梗死,证实EPC移植治疗是安全可行的。陈君柱等将体外扩增后自体EPC应用于临床治疗特发性肺动脉高压患者,2006年随机对照试验结束,结果显示EPC移植治疗特发性肺动脉高压是安全、可行和有效的。临床上开展EPC移植治疗需要大量细胞,来源难以保障,然而建立EPC库可以解决细胞来源的问题。成体EPC具有免疫原性,同种异体间移植会导致免疫排斥,临床应用有局限性。脐静脉来源的EPC几乎无抗原性,不易免疫排斥,且细胞含量丰富、体外增殖能力强,适宜于建库。本实验的目的:从人脐血中分离培养出内皮祖细胞,将其进行低温保存和快速复苏,建立EPC细胞系比较冻存前后细胞形态及生物学功能是否改变,胎儿脐带血EPC系的建立将为研究人类EPC的生物学功能及分化发育、内皮功能障碍性疾病的治疗等提供了丰富的种子细胞。为其建立人脐带血EPC库,并最终将其初步应用于冠状动脉粥样硬化性心脏病和特发性肺动脉高压的治疗。实验方法1.人脐血的采集:选择2009年3月至2009年9月在杭州市第一人民医院妇产科足月分娩的无传染性疾病健康妇女38例。待新生儿娩出后,在距脐轮约5～10cm处用止血钳夹住脐带的两端,于两钳之间剪断脐带,在产妇侧脐带的一端选择显露而粗大的脐静脉,穿刺成功后利用子宫阵发性收缩和注射器的负压让脐血顺利流入50ml的注射器内,采血完毕,及时钳住穿刺处。2.单个核细胞的分离和培养:在超净工作间内,利用密度梯度离心法将单个核细胞从脐血内分离出来,将细胞悬液接种于预先包被有人纤维连接蛋白(FN)的6孔板中,加入M199培养液和20%的胎牛血清,置放入37℃、5%的二氧化碳培养箱中,每5天对细胞换液继续培养。采用acLDL-Dil和FITC-UEA-I染色细胞,激光共聚焦显微镜初步鉴定,UEA-I和DiLDL双染色阳性细胞被认为是正在分化的EPC。3.细胞的冻存和复苏:将每例脐血经密度梯度分离及体外培养传代后所得到的内皮祖细胞平均分为两份,一份低温程序冻存作为实验组;一份未冻存继续体外培养作为对照组。利用配制好的冻存液稀释经离心收集的内皮祖细胞,调整细胞浓度,计数细胞总数,用移液器将其移入1.5ml的冻存管中,按照4℃20min—0℃30min—-20℃30min—-70℃置入冻存盒内,低温下(-70℃)长期保存。将冻存盒内的冻存管取出,迅速放入37℃水浴中并不停的摇动使其在1min内快速融化,加入上述培养液洗涤两次,去除冻存保护液的毒性作用,收集细胞计数细胞总数和计算细胞成活率,以待进一步实验。4.内皮祖细胞增殖能力的测定:2.5%的胰蛋白酶和0.2%的EDTA消化贴壁细胞,加入M199培养液,调整细胞浓度,按200μl/孔,接种于96孔板中,继续置入培养箱培养48h,吸弃细胞培养液,每孔加MTT液(5mg/ml)20μl,置于培养箱中培育4h。取出96孔板,每孔加入DMSO 200μl,充分振荡10min后酶标仪波长490nm处检测细胞OD值。5.内皮祖细胞粘附能力的测定:上述方法消化贴壁细胞,调整细胞浓度,加入预先包被FN的6孔培养板中,置入培养箱中1h,显微镜下读数。结果1.人脐静脉血经1:1稀释后缓慢加入人淋巴细胞分离液,离心后可见清晰的分层:最上层为血浆和血小板,中间白膜层为单个核细胞层,下层为分离液层,最下层为红细胞层;2.细胞形态学观察:密度梯度离心法所得的单个核细胞接种于培养板中,细胞呈圆形,大小均匀的分布在板底,5天后换液去除悬浮细胞,可见略呈圆形的贴壁细胞,细胞数量较少但有大量细胞集落形成;继续培养至第15天可见细胞数量较多,呈圆形椭圆形或者梭形,但细胞集落形成减少;3.经激光共聚焦显微镜初步鉴定,UEA-1和DiLDL双染色阳性细胞是正在分化的EPC;4.细胞的冻存和复苏:经培养换液所得的EPC经上述程序冻存和复苏后可测得细胞的存活率为(84.17±4.02)%,细胞的形态学未见明显改变;5.细胞增殖和粘附能力的变化:与未冻存的细胞相比,刚刚复苏后即行增殖和粘附能力的检测,细胞的增殖和粘附能力有显著变化P<0.05,细胞复苏后继续培养48h后行增殖和粘附能力检测,两者未见明显差异P>0.05。结论:对短期低温保存后复苏的EPC,即刻行增殖和粘附能力检测其能力均降低,复苏后继续培养48h后再次检测未见明显差异。