第一章钩端螺旋体赖株中一个新的类噬菌体片断的鉴定　　 使用钩端螺旋体(简称钩体)cDNA芯片比较了同属钩端螺旋体黄疸出血群赖型的强毒株赖株与减毒株IPAV株的基因表达谱差异，结果发现一个长度为22kb的基因簇(钩体赖株染色体上位置为LA0186基因到LA0219基因)，这个基因片断在两株菌中均有转录，但在强毒株中的转录水平要远高于在减毒株中的转录水平。RT-PCR结果显示这一片断包含5个转录单元。基因注释结果发现，这一片断的34个ORFs中，至少有8个基因编码噬菌体相关蛋白，分析推测其可能是一个缺陷噬菌体片断。Blast结果显示这一基因簇序列在两株菌中核酸序列完全一致，因此推断，调控这一片断出现明显差异转录表达的调控因子应该位于染色体的其它位置，而并不在这一基因片断内部。因此本研究重点对这一片断中一个可能的噬菌体调控蛋白——LA0195进行了鉴定。LA0195氨基酸序列上具有明显的DNA结合域，类似于λ噬菌体的重要调控蛋白CI，CI可以通过与相邻调控序列的结合来调控基因表达。通过生物信息学分析，在LA0195基因附近找到3个可能的启动子序列，分别对应转录单元Ⅰ、转录单元Ⅱ和转录单元Ⅳ。通过使用无启动子载体pKK232-8的报告系统，我们在E.coli体内通过ELISA方法测定了这3段可能启动子序列的启动子活性，结果表明，对应于转录单元Ⅰ和转录单元Ⅱ的可能启动子序列表现出了较强的启动子活性，而对应于转录单元Ⅳ的可能启动子序列则没有检测到启动子活性。这一结果与体外使用EMSA测定的结果一致——分别对应于转录单元Ⅰ和转录单元Ⅱ的启动子序列，在体外都表现出了较强的与LA0195蛋白结合的能力，而对应于转录单元Ⅳ的序列则没有检测到这种结合能力。因此，ELISA和EMSA结果都表明，LA0195蛋白功能上可以通过与转录单元Ⅰ和转录单元Ⅱ的启动子序列结合来调控相关基因的转录、表达，即LA0195基因编码了CI调控蛋白。　　 第二章钩端螺旋体赖株中葡萄糖激酶的鉴定　　 研究表明，钩端螺旋体体外培养中只能利用脂肪酸而无法利用葡萄糖作为碳源和(或)能源。以往研究认为钩端螺旋体中缺乏可以将葡萄糖磷酸化为6-磷酸葡萄糖的己糖激酶或葡萄糖激酶，从而直接导致了钩体无法利用葡萄糖作为碳源和(或)能源进行生长。本研究基于生物信息学分析结果，在钩端螺旋体赖株中成功鉴定到一个可以编码葡萄糖激酶(glucokinase，GLK)的基因——LA1437基因，将其称为LiGLK。氨基酸序列比对分析表明，LiGLK序列中包含ROK family特征序列，根据微生物中葡萄糖激酶的分类标准将其归为Ⅲ型葡萄糖激酶。我们在大肠杆菌中成功异源表达了LiGLK蛋白，纯化后对其生理生化性质进行了进一步鉴定。结果表明，LiGLK体外具有明显的葡萄糖激酶的催化活性，其最适反应温度为50℃，最适反应pH为9.0。酶动力学性质研究表明，LiGLK对两种反应底物D-葡萄糖和ATP的Km分别为430±79μM和1011±229μM。同时，我们也在钩体赖株粗酶液中检测到了葡萄糖激酶的活性。氨基酸序列比对还表明，LiGLK中ATP结合位点的氨基酸序列与Ⅲ型葡萄糖激酶中保守的ATP结合位点处的氨基酸序列存在两个氨基酸的差别，文献报道，差别位置处的氨基酸很可能参与了酶与底物结合作用力的形成。于是我们对这两个氨基酸位点进行了突变试验，回复突变为保守的氨基酸序列，结果发现并没有提高LiGLK与底物ATP的结合能力，因此很可能野生型LiGLK中的氨基酸突变并没有影响酶与底物的结合能力。本研究首次通过试验证明了钩端螺旋体赖型菌株中葡萄糖激酶的存在，并且证明这个酶在钩体体内是表达的。葡萄糖激酶的鉴定为钩端螺旋体赖株中存在糖酵解途径提供了进一步的试验证据。针对钩端螺旋体体外生长无法利用葡萄糖的原因可能是葡萄糖转运系统低效率的观点，基于生物信息学分析果和蛋白质谱数据，我们认为提出观点的证据并不充分，对于钩端螺旋体利用葡萄糖的内容还需要进一步研究。