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实验目的病理性瘢痕是皮肤纤维异常增生、创面过度修复的产物,临床上分为增生性瘢痕和瘢痕疙瘩两种类型。其外观丑陋,可使患者产生一定的自觉症状(瘙痒、刺痛、局部过度敏感等),伴有各种程度的功能障碍,尤其破溃后,常产生经久不愈的溃疡,亦可发生恶变,严重危害人们的身心健康。所以,对病理性瘢痕的治疗迫不及待。而病理性瘢痕的治疗很大程度上依赖于对其发病机制的明了。但其发病机制十分复杂,国内外许多学者已从皮肤张力、部位、年龄、皮肤色素、感染、异物和遗传机制等方面对病理性瘢痕的发病机制进行了一系列的研究,但仍不能由任何单一因素来完整解释,多种因素的共同作用是学者们目前普遍接受的观点。我们通过研究Smad2.Smad3和β-环连蛋白(β-catenin)在病理性瘢痕中的表达情况,探讨TGF-β/Smad信号转导通路和Wnt/β-catenin信号转导通路在病理性瘢痕发病机制中的作用及相互关系,为临床预防和治疗瘢痕提供细胞生物学、分子生物学及病理学水平的理论依据。实验方法随机选取瘢痕疙瘩患者30例为A组,增生性瘢痕患者30例为B组,同时随机选取其他整形美容手术患者切除的正常皮肤组织20例,作为对照C组。在室温下,将冰冻切片置于丙酮固定30分钟后,PBS冲洗3次(每次3分钟),再经阻断内源性过氧化物酶活性10分钟,免疫羊血清阻断非特异性抗原10分钟后,分别加抗Smad2+Smad3抗体和抗β-catenin抗体即一抗(1：100稀释),4℃湿盒过夜,滴加1：200稀释生物素化二抗,37℃恒温孵育20分钟,滴加1：200稀释链霉菌素抗生物素过氧化物酶复合物即三抗,37℃恒温孵育20分钟,各步骤之间均用缓冲液洗3次。AEC显色后苏木精复染。阴性对照组省略第一抗体,用PBS缓冲液代替。封片,保存,镜下观察,照相。综合考虑切片中阳性细胞所占同类观察细胞总数的百分比及阳性细胞的着色强度两项指标的差异。采用SPSS12.0统计软件进行非参数Kruskal-Wallis检验统计分析,取α=0.05,即P<0.05时认为有统计学意义。实验结果一、Smad2、Smad3和β-catenin在病理性瘢痕组织中的定位1. Smad2、Smad3的表达定位于真皮内成纤维细胞的细胞浆和细胞核内,为红色颗粒,呈弥漫性分布。2.β-catenin的表达主要定位于在真皮内成纤维细胞细胞浆,为红色颗粒状,呈弥漫性分布,在细胞核内也有发现。二、Smad2、Smad3和β-catenin在成纤维细胞中的表达及对比1. Smad2、Smad3在A、B组中的阳性率高于C组,但三组之间差异不具有统计学意义(P>0.05),而在核内积聚较C组明显,且其差异具有统计学意义(P<0.05)。2.β-catenin在A、B组超过半数的成纤维细胞中呈阳性或强阳性表达,在C组中低表达或不表达。A、B组与PBS组比较其差异有统计学意义(P<0.01),但A、B组之间比较其差异无统计学意义(P>0.05)。实验结论1. Smad2、Smad3表达增高或核内积聚是病理性瘢痕等纤维化疾病的重要机制之一,即TGF-β/Smad信号转导通路对病理性瘢痕的形成起到重要作用。2.β-catenin的过度表达也是病理性瘢痕等纤维化疾病的重要机制之一,即Wnt/β-catenin信号转导通路对病理性瘢痕的形成起到重要作用。3. TGF-β/Smad信号转导通路与Wnt/β-catenin信号转导通路联合作用,引起控制细胞增殖分化的因子的转录和表达,进而调控真皮成纤维细胞的增殖表达和分泌,抑制细胞凋亡,最终导致胶原持续性过度沉积,形成病理性瘢痕。