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γ-亚麻酸(Gamma Linolenic Acid,GLA)是一种多不饱和脂肪酸,分子式为C18H30O2,化学名称为6,9,12-十八碳三烯酸,简写为△6-9-12-18:3,在碳链的6,9,12位各有一个双键。目前研究发现,GLA具有降血脂、降血压、降低高血脂病人的血脂和血清胆固醇水平,抗炎消炎,抗肿瘤,抗菌作用以及防治过敏性皮炎,用于化妆品能改善皮肤的干燥现象,产生润滑舒适的作用等功能。γ-亚麻酸代谢途径中的关键酶△6-脂肪酸脱氢酶(Delta6-fatty Acid Desaturase,D6D),在不饱和脂肪酸的第6位和第7位碳原子脱氢引入双键。大豆富含亚油酸,而γ-亚麻酸的含量极低。本论文进行了产生γ-亚麻酸转基因大豆新种质的研究。主要结果如下: 1.从琉璃苣(中国境内生长)中,克隆了D6D基因,得到的cDNA全长序列。测序结果为:D6D基因cDNA全长为1359个核苷酸,编码452个氨基酸。将测序结果在genbank中进行BLAST同源序列分析,与登录的美国德克萨斯州的琉璃苣D6D基因序列同源性为99%。 2.将D6D克隆到pGEM—easy Vector形成质粒pGD6D,把质粒pGD6D上的D6D片段克隆进含有35S启动子的质粒pRTL2中,形成含有目的基因的表达载体pRT-D6D,把质粒pRT-D6D上的含有启动子和目的基因的片段克隆进含有T-DNA的质粒pPTN-200中,形成共转化表达载体pPTN-D6D;利用三亲杂交、热激、电击的方法将共转化表达载体pPTN-D6D转入到根癌农杆菌EHA105中,构建转化大豆的工程菌。 3.以绥农27,绥农24,蒙豆30,中豆32,小粒豆,黑农37,垦农18为材料,进行了不同大豆品种子叶节诱导率的统计,筛选出了子叶节丛生芽诱导率较高的品种小粒豆和垦农18,两者的丛生芽诱导率分别为86.75%、88.25%。 4.利用农杆菌介导转化子叶节法将D6D转入到筛选出的小粒豆和垦农18中;利用大豆组织培养获得大豆转化再生植株,用分子生物学方法对再生大豆植株进行检测。获得了10株抗性再生植株,实际转化率为1.05%。PCR检测结果表明,目的基因已经初步整合到了大豆的基因组上的植株为4株。 本研究结果对研究大豆品质改良和脂肪酸脱氢酶调控机制等具有深远意义,为基因工程手段生产γ-亚麻酸奠定了基础。