论文部分内容阅读
目的： 1．观察大鼠眼压的昼夜节律，建立稳定的大鼠慢性高眼压模型： 2．建立高眼压大鼠Cop-1免疫模型，从形态学上观察Cop-1诱导的自体免疫对视网膜节细胞及视网膜全层的影响； 3．观察Cop-1诱导的自体免疫对视网膜Mǖller细胞中细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)的影响，探讨细胞外信号调节蛋白激酶在保护视网膜节细胞中的作用； 4．检测Cop-1免疫高眼压大鼠后视网膜中自细胞介素-6的变化，探讨白介素-6在高眼压状态下对视网膜节细胞的保护作用。 方法： 1．用笔式眼压计Tono-pen分别于早晨7：00和晚上10：00测量正常大鼠眼压，连续测量1周。利用统计学配对t检验对大鼠昼夜眼压进行分析。 2．建立大鼠慢性高眼压模型：戊巴比妥钠行腹腔麻醉，丁卡因点眼行眼表麻醉，剪开颞侧球结膜，暴露巩膜浅层静脉，烧烙2条浅层巩膜静脉。术后即刻、术后30 min、1h、12h、1d、1wk、4wk、8wk分别测量各组眼压，将各组术后各时段所测平均眼压值绘制曲线图，并于术后观察术眼的局部表现。 3．建立大鼠高眼压免疫模型：建立高眼压模型后即刻大鼠后肢第四军医大学硕士学位论文 皮下注射200ugCop一1(溶于完全弗氏佐剂)，2周及4周后重 复注射20OugCop一1(溶于不完全弗氏佐剂)。8周后，从心脏 取血，离心取上清夜，ELISA检测Cop一1抗体效价。4.视网膜形态学观察:将动物分为正常组、高眼压组及高眼压 免疫组，术后8周，戊巴比妥钠行腹腔麻醉，4%多聚甲醛灌 流固定，恒冷箱切片机切片，厚度18um，贴于明胶玻片。室 温干燥30分钟后，放入一20℃保存。染色前，将组织切片， 在室温晾干2小时。常规HE染色，光镜观察视网膜形态学变 化并对各层厚度进行测量，对节细胞层细胞数进行计数。 TUNEL染色检测视网膜节细胞凋亡。5.免疫组织化学检测:利用免疫组化及免疫荧光双标的方法观 察细胞外信号调节激酶(ERK)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、波 形蛋白(Vimentin)、白细胞介素一6(工L一6)在各组视网膜的 表达及分布。结果:1.大鼠白天正常眼压界于1.06 KPa一1.99 KPa之间，平均眼压 值为(1.56士0.25)Kpa;夜间正常眼压界于1.73 Kpa一2.66 Kpa之间，平均眼压值为(1 .86士0.23)KPa，大鼠夜间平均眼 压高于白天。2.烧烙2条浅层巩膜静脉，可以使术后8周大鼠平均眼压维持 在(4.04士0.21) Kpa，且无严重并发症产生。Cop一1免疫大鼠 后8周，血清中Cop一抗体阳性，效价高于1:1000。3.HE染色结果显示高眼压组视网膜比正常组明显变薄，结构层 次不清楚，内核层、外丛状层和杆锥层尤其明显，高眼压组 外丛状层和内核层几乎消失。高眼压免疫组视网膜形态与正 常组较为一致。正常组节细胞计数平均值为(22.5士1.18)个， 高眼压组节细胞计数平均值(15.5士0.85)个，高眼压免疫 组为(20.5士1.43)个。统计学分析显示高眼压免疫组及正第四军医大学硕士学位论文 常组节细胞数明显高于高眼压组，尸<0.01，而正常组与高眼 压免疫组之间节细胞数没有明显差别。TUNEL染色显示高眼压 组节细胞凋亡数明显高于另外两组。4.免疫组化结果显示，ERK、GFAP、Vimentin及IL一6在高眼压 组及高眼压免疫组视网膜均高度表达，在高眼压免疫组表达 尤为显著。免疫荧光双标结果显示，视网膜Mul ler细胞中ERK 信号转导通路磷酸化激活。结论:1.大鼠基础眼压具有昼夜节律，夜间眼压升高，白天眼压下降。 烧烙法阻断2条巩膜浅层静脉是建立稳定慢性高眼压模型的 有效方法。大鼠后肢皮下注射Cop一可以建立有效的免疫动 物模型。2.高眼压对视网膜的损害是全层次的，高眼压损伤不仅会影响 到视网膜节细胞，同时也会影响到视网膜的其他非神经元类 细胞。Copq诱导的自体免疫反应可以对高眼压状态下的视网 膜起到保护作用，减少节细胞的凋亡。3.高眼压状态下Mul ler细胞中ERK信号转导通路磷酸化激活， GFAP、vimentin活性增强，Cop一1免疫动物后，它们的活性 会进一步增强。ERK、GFAP、Vimentin通过Muller细胞与神 经元的相互联系，促进节细胞存活，抑制细胞凋亡。4.高眼压状态下视网膜中IL一6表达增强，C叩一免疫动物后会 进一步增强IL一6的活性。IL一6通过工L一6受体(IL一6R)发挥 其生物活性作用，促进神经元细胞存活，抑制细胞凋亡。