受体酪氨酸激酶属于蛋白酪氨酸激酶家族,是一类细胞膜表面受体,其配体一般为生长因子,细胞因子以及激素。受体酪氨酸激酶不仅可以在正常细胞中调节细胞活动,而且在许多的癌细胞中会促进其增殖。受体酪氨酸激酶上的一些氨基酸突变会引发下游的级联信号,从而影响多个蛋白的表达水平,进一步影响细胞增殖。C-MET蛋白是受体酪氨酸激酶家族的一个成员,由MET基因编码,为单次跨膜受体,其配体为肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)。C-MET蛋白通常由上皮细胞表达,肝细胞生长因子一般由间叶细胞表达,一旦肝细胞生长因子与c-MET结合,肝细胞生长因子就会引起c-MET的二聚化并激活c-MET的激酶活性。在癌细胞中的非正常c-MET蛋白激活与癌症的不良预后相关,其激活可以促进肿瘤的增殖、肿瘤组织部位血管发生和肿瘤细胞转移。该信号通路在包括肾脏、肝脏、胃和乳腺等诸多组织中的肿瘤中都存在失调,这就使c-MET成为肿瘤靶向治疗的重要靶点。阻断肝细胞生长因子和c-MET蛋白的结合是c-MET靶向治疗的主要策略。抗体药物由于其靶向性好,副作用小的优势在肿瘤相关抗原的靶向治疗中发挥了很强大的功能,而纳米抗体以其分子小、易改造、稳定性高等特点受到研究者关注,目前纳米抗体药物的研究也如火如荼。本研究中以c-MET蛋白为靶标,研究针对c-MET蛋白的纳米抗体,并检测该纳米抗体对c-MET蛋白特异性肿瘤细胞的抑制作用。本论文具体内容如下:1、靶向c-MET特异性纳米抗体的制备已有的研究显示,c-MET/HGF信号通路中,c-MET蛋白是通过其信号素(Semaphorin,Sema)结构域与HGF发生结合,为获得可阻断二者结合的抗体,本研究中分别采用了Sema结构域和c-MET蛋白胞外全长用于动物的免疫和抗体的筛选。在动物免疫以后,成功构建库容为1×10~8的c-MET纳米抗体文库,通过噬菌体展示的技术,结合生物淘选的方法,经ELISA鉴定和测序分析,最终确定有33株纳米抗体与c-MET蛋白胞外全长具有特异性结合。将33株纯化后纳米抗体分别处理肝癌细胞HepG2,结果显示有18株纳米抗体对HepG2细胞的增殖有抑制作用,另外15株抗体对HepG2细胞的增殖有促进作用,其中具有抑制作用的18株抗体中有10株抗体的抑制作用较强。2、靶向c-MET特异性纳米抗体的原核表达、表征和功能分析将10株对癌细胞增殖抑制能力较强的纳米抗体分别亚克隆到原核表达载体中,成功纯化制备了大量的10株纯化后纳米抗体,并利用生物膜干涉技术测定了纳米抗体与c-MET蛋白的亲和力常数以及每株抗体间的抗原表位竞争关系,通过免疫印迹的方法检测单个纳米抗体和10株纳米抗体混合物(TOP10MIX)对HepG2细胞的c-MET蛋白及其磷酸化水平的影响,结果显示TOP10MIX对癌细胞中c-MET蛋白的降解和去磷酸作用最强。随后本研究又检测了TOP10MIX对不同癌细胞的增殖和克隆形成能力的影响,结果显示TOP10MIX对不同癌细胞的抑制效果都非常显著。为了检测抗体数量更少的纳米抗体组合的癌细胞抑制效果,依据抗原表位竞争关系以及纳米抗体氨基酸序列CDR3区的差别,我们将10个纳米抗体分组,通过肿瘤细胞增殖抑制实验,最终确定包含不同抗体数目的最优组合分别为5G7、4G3、3G4和2G1。通过免疫印迹的方法检测5G7、4G3、3G4、2G1和TOP10MIX对HepG2中c-MET蛋白及其磷酸化水平的影响,结合其癌细胞增殖抑制能力,结果显示在体外癌细胞抑制实验中TOP10MIX的效果要显著优于2G1。3、TOP10MIX在动物肿瘤模型的作用和机理研究制备了总量约200mg的纯化后纳米抗体,检测了TOP10MIX对不同肿瘤细胞中c-MET及其磷酸化蛋白的影响,结果显示TOP10MIX同样可以诱发c-MET蛋白的降解并降低了磷酸化MET蛋白的水平,在动物肿瘤模型中具有很强的肿瘤抑制作用,通过肿瘤组织的免疫印迹检测,我们发现TOP10MIX在动物肿瘤模型中也可以诱发c-MET蛋白的降解且抑制c-MET蛋白的磷酸化。通过膜蛋白分离实验分析,我们发现c-MET的降解主要是通过膜蛋白的内吞实现的,而该内吞作用是网格蛋白介导的。与单价抗体5D5相比,TOP10MIX具有更强的肿瘤抑制作用。