背景铅在环境中大量存在,广泛分布,已经成为常见的工业和环境毒物。铅被用做汽油添加剂,导致了严重的大气污染,铅还作为增白剂使用于化妆品等。铅在工业上是一种重要的化学物质,而在人体内却是一种有害的物质。众多的研究表明铅对人体健康可产生持续的、慢性损伤。近年来,环境污染特别是铅的污染受到社会各界的广泛重视,其导致的疾病及致病机制是我们关注的热点,人们致力于防治铅毒害,减少或减轻铅毒害。细胞凋亡是在人和动物的多种组织中发现的一种程序性细胞死亡过程,可在机体的正常生理过程中存在,与生长、分化同样重要,是当今生物和医学科学领域中的新兴课题与热点。目前的研究表明,金属元素可以诱导细胞凋亡的发生,并表现出与凋亡具有较为复杂的关系。因此近年来有关金属元素与细胞凋亡的研究日益受到重视。细胞内钙浓度的升高或下降可引起一系列细胞生物学反应,如神经递质分泌、骨骼肌收缩等快速反应,以及细胞分化、有丝分裂、细胞凋亡等慢速反应。研究显示,无论是在早期还是晚期细胞内钙浓度的升高都有促细胞凋亡作用。[Ca2+]i升高导致细胞凋亡的机制尚不十分清楚,可能与下列途径有关：(1)导致DNA损伤：首先,[Ca2+]i升高可通过激活Ca2+/Mg2+依赖性核酸内切酶,导致DNA的断裂。其次[Ca2+]i升高可能通过某些机制(如组蛋白I重新分布和拓扑异构酶Ⅱ活化)而影响染色体的结构,使之出现解折叠,扭转张力减低和超螺旋构象的改变,而使DNA易于被DNase降解。(2)作用于非DNA结构：如激活蛋白酶和谷氨酰胺转移酶,前者可进一步激活或修饰细胞骨架蛋白和某些蛋白激酶,导致细胞骨架的降解；后者正常时在胞质蛋白和膜结合蛋白间起交联作用,凋亡时活性增高,尤以凋亡小体中增高最明显,不仅与凋亡细胞的形态变化有关,而且可能通过交联而形成的钢性网架,使质膜的抗溶解能力增强,从而保持细胞膜的完整性,防止细胞内容物的外漏。钙池操纵的通道(store-operated calcium channels, SOCs)广泛存在于非兴奋性细胞膜上,是胞外内流的主要通道之一,参与多种病理和生理过程。SOCs的研究对于进一步完善非兴奋性细胞的钙通道特性及其调节机制的理论具有重要意义,并为临床解决诸如肝细胞钙超载等难题提供有力的理论和实验依据,因此受到越来越广泛的重视。积极寻找和应用SOCs的特异性工具药,不但对非兴奋性细胞SOCs的鉴定和深入研究非常必要,而且将为开发一类非兴奋性细胞的特异性钙拮抗剂奠定基础。因此,本研究主要探讨乙酸铅(Lead acetate)处理体外培养细胞,观察其对培养细胞是否通过SOCs影响钙紊乱从而发挥毒性效应,为进一步研究铅毒性的分子机制提供数据。方法1.将人胚胎肾细胞HEK293置于5%CO2,37℃培养箱内培养,分别以O、50、100、200、500μM铅(Pb2+)处理细胞24小时后,使用流式细胞技术检测不同浓度组细胞凋亡变化情况。2.用hoechst33342染色方法检测铅处理人胚胎肾细胞HEK293后细胞核形态学变化情况。3.不同浓度铅处理细胞24小时后,应用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)检测,不同浓度组胞内Pb2+含量。4.使用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM),记录细胞在铅刺激下,胞质及细胞器内质网中钙离子的变化情况。结果1.不同浓度铅(Pb2+)诱导HEK293细胞凋亡率的影响分别以0、50、100、200、500μM铅(Pb2+)处理HEK293细胞24小时后,流式细胞仪检测细胞凋亡率,结果显示,各浓度组Pb2+处理24小时后细胞凋亡率与对照组相比显著升高(P<0.01)。以上结果表明,Pb2+可诱导HEK293细胞凋亡,并具有剂量反应关系。2.铅(Pb2+)诱导HEK293细胞发生凋亡的形态学表现用hoechst33342染色方法检测铅处理HEK293细胞后细胞核形态变化。结果显示100μMPb2+作用HEK293细胞24小时后,HEK293细胞核出现明显的核浓缩、染色质片段等细胞凋亡的特征性表现,并形成典型的凋亡小体。3.不同浓度Pb2+处理HEK293细胞,进入胞内的Pb2+含量测定Pb2+进入细胞的方式与Ca2+相似,我们的研究证明,应用ICP-MS法检测不同浓度的铅处理组,胞内铅含量与胞外铅处理组呈浓度依赖性。然而使用SOC的抑制剂2-APB显著降低铅的进入量。4.不同条件下,胞质及内质网中游离Ca2+变化情况在胞外有钙的情况下,用不同浓度的Pb2+刺激HEK293细胞,用激光扫描共聚焦实时监测胞质中游离Ca2+发现,随着胞外Pb2+的升高,胞质中游离Ca2+的升高幅度也相应增高,且呈浓度依赖性。在胞外有钙的情况下,使用SOC的阻断剂2-APB预孵后,再用100μMPb2+刺激发现,2-APB孵育组与对照组相比,胞质中游离Ca2+增幅度明显减小,说明胞质中游离Ca2+增加可能来自胞外游离钙。在胞外有钙和无钙的情况下,分别用100μM Pb2+刺激发现,胞外无钙组与胞外有钙组相比,胞质中游离Ca2+增幅度下降,也说明胞质中游离Ca2+增加可能来自胞外游离钙。在胞外无钙的情况下,同样用100μM Pb2+刺激细胞,监测钙库内质网中游离Ca2+浓度变化发现,内质网中游离Ca2+浓度明显下降,说明钙库内质网中的游离Ca2+外排,使得胞质中游离Ca2+浓度增加。结论本研究的实验结果显示,Pb2+可诱导非兴奋性HEK293细胞胞质中游离Ca2+的浓度升高,可能通过钙库钙的释放,且激活胞外钙离子的内流而导致的,即通过SOC通路使得胞外钙内流,再加上胞外铅离子的进入,共同促进细胞的凋亡。说明SOC介导的细胞外钙、铅内流在Pb2+诱导HEK293细胞凋亡过程中发挥一定作用。