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背景:股骨头坏死(Osteonecrosis of the femoral head,ONFH)是由遗传易感因素和环境因素共同作用引起的复杂性疾病,病变骨髓腔往往充填了大量脂肪组织,因而脂代谢紊乱早已被公认为ONFH核心发病环节。随着ONFH发病率的逐年增加及对人类健康威胁的日益突出,ONFH的分子发病机制愈来愈成为骨科领域关注的热点。鉴于动物实验及临床研究已充分证实,高脂环境可以抑制成骨细胞的分化,高脂血症后骨髓内脂肪细胞增多增大压迫股骨头微血管引起骨细胞缺血性坏死,较早就推测成脂与成骨的转分化异常可能在ONFH发生发展中起关键作用,但一直不清楚脂肪蓄积的分子机理。近年对骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)分化微环境的研究,惹人注目地发现了关键转录因子PPARγ(peroxisome proliferator activated receptorγ)在调节成脂、成骨分化中的关键作用。作为成脂分化的主调控器,PPARγ在脂肪细胞、BMSCs分化序贯的分子级联事件中,被广泛应用作为成脂分化的标志。本项目团队最近应用质谱技术对ONFH病例对照体系的研究率先发现,PPARγ基因启动子rs2920502突变(CC型)与中国汉族人群ONFH发病风险显著相关,且同步分析发现ONFH患者血清甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-c)含量及LDL-c/HDL-c比值显著升高,高密度脂蛋白(HDL-c)含量显著减低,尤为重要的是这个启动子突变CC基因型显著相关于ONFH患者血清TG水平,首先证实了作为脂肪形成主调节器的PPARγ基因启动子突变显著相关于ONFH发病风险及其脂代谢紊乱。ONFH分子机理研究的标志性进展是确认了多个易感基因相关于ONFH风险,但由于缺乏突变基因的功能验证,难以确认其在ONFH发生中的作用。鉴于PPARγ对成骨与成脂分化的独特调节作用,以及项目团队的PPARγ基因启动子突变介入ONFH发病风险的新发现,PPARγ很可能在启动及加重ONFH病变股骨头脂肪蓄积的分子事件中起关键作用。为进一步阐述PPARγ启动子突变在ONFH发生中的分子机理,本研究建立了ONFH病例对照体系,体外分离与培养入组病例BMSCs,进行PPARγ启动子rs2920502位点基因分型,系统研究不同PPARγ启动子rs2920502位点分型对BMSCs成脂成骨转分化作用的影响;不同PPARγ启动子rs2920502位点分型对BMSCs PPARγ转录与翻译水平表达的影响;PPARγ启动子突变对BMSCs成脂成骨转分化作用涉及的关键分子标志物的影响及PPARγ基因启动子突变对其活性影响的荧光素酶报告基因验证。解析PPARγ启动子突变与ONFH脂肪蓄积之间的内在关系,阐述PPARγ启动子突变引起ONFH脂肪蓄积的分子机制,为建立ONFH的分子水平防治对策提出科学依据及潜在分子靶点,促进分子病因学研究与ONFH的临床防治及早对接。研究方法:1.采集关节外科54例ONFH手术患者骨髓血10ml,32例股骨颈骨折手术患者骨髓血10ml,采用梯度离心法分离BMSCs,应用低糖DMEM培养基贴壁培养BMSCs。应用相差显微镜观察细胞形态学及生长情况。2.应用流式细胞仪对BMSCs进行细胞表面抗原及细胞周期检测,CCK-8方法检测细胞增殖能力。3.应用Sanger测序法对54例ONFH组和32例对照组BMSCs进行PPARγ启动子rs2920502位点的基因分型。4.应用成脂、成骨分化诱导试剂盒诱导培养的BMSCs向成脂成骨分化。应用茜素红染色、油红O染色及定量萃取的方法对BMSCs成脂成骨分化能力进行分析。5.应用qRT-PCR、Western blot方法检测PPARγ及成脂成骨关键基因在BMSCs成脂成骨过程中的表达。6.应用PCR技术分别从具有rs2920502 GG型与CC型的BMSCs细胞DNA基因组克隆PPARγ基因启动子片段,将获取的启动子片段重组入荧光素酶报告基因慢病毒表达载体,构建成能够检测具有rs2920502不同分型的启动子在细胞内调控基因表达活性的慢病毒载体。7.应用293FT细胞完成了慢病毒的包装与制备,应用流式细胞仪计算慢病毒滴度。将包装慢病毒感染BMSCs细胞,通过荧光显微镜观察病毒感染情况。8.通过双荧光素酶活性检测评估不同PPARγ启动子rs2920502基因型的启动子活性。实验结果:1.成功分离培养了来自54例ONFH患者和32例股骨颈骨折手术患者股骨干近端骨髓血的BMSCs,培养的BMSCs符合间充质干细胞形态学特征,细胞表面CD73、CD90及CD105抗原表达阳性,CD34和CD45抗原表达阴性。ONFH与对照组患者分离培养的BMSCs细胞周期无显著统计学差异,ONFH组BMSCs增殖能力略低于对照组,但两组间无显著统计学差异。2.油红O与茜素红染色及其定量分析显示,ONFH BMSCs成脂分化能力显著强于对照组(P<0.05),ONFH组BMSCs成骨能力显著弱于对照组(P<0.05);qRT-PCR检测BMSCs成脂成骨分化相关基因表达结果,ONFH组BMSCs成脂相关标志物PPARγ、维甲酸受体α(RXRα)、转录因子CCAAT/增强子结合蛋白α(CEBPα)、脂蛋白脂酶(LPL)及脂肪酶(Adipsin)表达量显著高于对照组(P<0.05)。ONFH组BMSCs成骨相关标志物果蝇同属Runt相关转录因子2(RUNX2)、碱性磷酸酶(ALP)、骨形态发生蛋白2(BMP2)、骨桥蛋白(OPN)、锌指结构转录因子(Osterix)的表达量显著低于对照组(P<0.05),阐述了ONFH BMSCs成脂成骨转分化障碍的特点及其关键分子靶点。3.首次完成了ONFH病例对照体系BMSCs PPARγ启动子rs2920502的基因分型,ONFH组BMSCs rs2920502分型分布为GG型32例,GC型19例,CC 3例,对照组rs2920502分型分布GG型16例,GC型15例,CC型1例。基因分型的结果与本项目组前期在361例ONFH病例对照体系外周血单个核细胞(PBMC)基因组分型结果的分布趋势一致,为进一步阐述PPARγ启动子突变对成脂成骨转分化的影响奠定了关键基础。4.不同基因分型BMSCs成脂成骨分化能力结果显示,ONFH组和对照组BMSCs PPARγ启动子rs2920502 CC型成脂能力显著高于GG型(P<0.05),而成骨能力显著低于GG型(P<0.05),率先阐述了PPARγ启动子突变影响BMSCs成脂成骨分化能力的科学证据。5.PPARγ启动子突变对其基因表达影响的研究结果发现,BMSCs在成脂诱导后第7天,两组BMSCs CC型PPARγ表达量均显著高于GG型和GC型(P<0.05);在成脂诱导后第14天,ONFH组CC型PPARγ表达量显著高于GG型和GC型,对照组CC型PPARγ表达量也显著高于GG型(P<0.05)。ONFH组和对照组之间BMSCs不同基因分型的PPARγ表达量分析发现,在成脂第7天,ONFH组GC型和CC型PPARγ表达量均显著高于对照组GC型和CC型,在成脂第14天,ONFH组GG型、GC型及CC型PPARγ表达量均显著高于对照组GG型、GC型及CC型(P<0.05),率先提出了PPARγ启动子突变影响其基因表达的实验证据。6.PPARγ启动子突变相关的关键分子标志物研究结果发现,成脂诱导后,ONFH组和对照组BMSCs CC型成脂标志物RXRα、CEBPα、LPL表达量显著高于GG型(P<0.05)。在成骨诱导后,ONFH组和对照组BMSCs CC型成骨标志物RUNX2表达量显著低于GG型(P<0.05),ONFH组BMSCs CC型成骨标志物Osterix表达量亦显著低于GG型(P<0.05)。而且,成脂诱导后ONFH组GG型、GC型及CC型RXRα、CEBPα、LPL及Adipsin表达量均显著高于对照组GG型、GC型及CC型(P<0.05)。成骨诱导后ONFH组GG型、GC型及CC型成骨标志物RUNX2、BMP2、OPN、ALP及Osterix表达量均显著低于对照组GG型、GC型及CC型(P<0.05),率先阐述了PPARγ启动子突变引起ONFH BMSCs成脂成骨转分化异常的关键分子靶点。7.成功构建了PPARγ启动子rs2920502慢病毒表达载体LV-pPPARγ-GG和LV-pPPARγ-CC,通过酶切、基因测序鉴定证实序列及插入方向正确,并实现了慢病毒载体在293FT细胞的成功包装,慢病毒滴度为3.49 x10~8 TU/mL。荧光素酶活性检测结果显示,慢病毒载体感染BMSCs在转染72h后,转染LV-pPPARγ-GG和LV-pPPARγ-CC慢病毒颗粒的细胞荧光素酶活性无明显差异。在成脂诱导第7天、第10天及第14天,LV-pPPARγ-CC荧光素酶活性明显高于转染LV-pPPARγ-GG慢病毒载体组,率先阐述了PPARγ启动子rs2920502突变引起PPARγ启动子活性增强,不仅为阐述ONFH成脂成骨转分化障碍的分子机制提出了创新思路,也为ONFH人群的分子水平防治提出了潜在分子靶标。本研究结果提示,PPARγ启动子正常功能维持PPARγ成脂分化主调节器作用,主导BMSCs分化微环境及其主要靶分子的功能朝向成骨分化的方向,成脂分化受抑;而PPARγ基因启动子rs2920502突变(CC型)后,导致启动子活性亢进及PPARγ基因表达增强与功能紊乱,引起PPARγ主导BMSCs的分化微环境调控成骨及成脂分子开关的系统功能紊乱,改变BMSCs分化微环境的主导分化方向,使成骨分化障碍,成脂分化凸显,在环境因素影响下,股骨头局部骨髓腔脂肪组织渐进性蓄积,引起ONFH的发生发展。本研究结果率先解析了PPARγ启动子突变后引起ONFH BMSCs成脂与成骨转分化障碍,并通过其关键分子靶点引发与加重ONFH的脂肪蓄积,解析PPARγ启动子突变—调控分子谱异常—ONFH脂肪蓄积之间的内在关系,阐述PPARγ启动子突变引起ONFH脂肪蓄积的分子机制,为建立ONFH的分子水平防治对策提出科学依据及关键分子靶点,为进一步用于ONFH的易感人群筛查及早期干预,促进分子病因学的研究成果与ONFH的临床防治及早对接奠定了科学基础。