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目的探索榄香烯对气道肉芽、人类气道原代成纤维细胞的作用及其潜在的机制。内容随着结核、气管内插管等发病趋势的上升,气道狭窄的发病率也随之升高,部分患者采用支气管镜引导下的介入治疗时,存在病情反复,疗效欠佳的现象。探索新的治疗途径有着重要临床意义。如何调节机体创伤和修复的平衡,中草药的提取物因其疗效好和细胞毒性小日益受到重视。榄香烯是从姜科植物温莪术提取的菇烯类化合物,经乳化处理的注射剂已广泛应用于临床抗肿瘤治疗。亦有研究表明榄香烯具有抑制成纤维细胞和晶状体上皮细胞,甚至具有抗肝纤维化的作用。因此尝试体外建立人类气道原代成纤维细胞模型,榄香烯干预,体内支气管镜引导下对人类气道肉芽组织局部注射榄香烯,以观察榄香烯的药理作用,并从分子水平(caspase-3凋亡蛋白、caspase-3 m RNA、差异mi RNA)探索潜在的作用制。一旦证实有效,这将为治疗难治性气道狭窄、降低复发率提供一种新的治疗方法。方法1、体外采用改良法培养人类气道原代成纤维细胞并进行鉴定及纯化。2、将细胞分为阴性对照组(NS组即生理盐水组)和实验组(榄香烯乳剂组),光镜下、电镜下观察两组细胞的形态学差异;MTS法测定上述两组细胞的生长增殖率;流式细胞仪检测上述两组细胞的凋亡率;3、将细胞分为阴性对照组(NS组)和阳性对照组(DXM组即地塞米松组)以及实验组(榄香烯乳剂组),Western-blot法检测三组细胞caspase-3的蛋白含量;RT-PCR检测上述3组细胞caspase-3的m RNA含量。4、将细胞分为阴性对照组(NS组)和实验组(榄香烯乳剂组),分别提取总RNA并进行质检,合格后构建RNA混池,构建c DNA测序文库,对mi RNA进行高通量测序(第二代高通量测序HISEQ2500),处理测序数据,实验重复三次,筛选阴性对照组(NS组)和实验组(榄香烯乳剂组)气道成纤维细胞的差异表达的mi RNA;RT-PCR验证差异表达的mi RNA,保留可信的差异mi RNA,并预测相应的靶基因。5、难治性气道狭窄患者1名,支气管镜引导下局部注射榄香烯,观察疗效;治疗前后均在支气管镜引导下钳取肉芽组织,进行HE染色,光镜下观察对比。结果:1、联合“组织贴壁法”和“胰酶消化法”,在此基础上加用“血清贴壁”、“组织压片”、“原孔消化”等改良方法,体外成功培养并纯化人类气道原代成纤维细胞。2、光镜下相对于对照组,榄香烯组细胞生长不良,细胞成团,胞浆颗粒增加;电镜下榄香烯组细胞,出现胞浆颗粒沉积,部分出现坏死,未见细胞核及细胞器;NS组细胞随着NS浓度增加,细胞增值率无明显改变,榄香烯组细胞随着榄香烯浓度增加,细胞增值率下降(P<0.05);相对于对照组,随着榄香烯药物浓度增加,细胞的坏死率和凋亡率逐渐升高(P<0.05)。3、NS组、DXM组、榄香烯乳剂组三组caspase-3凋亡蛋白表达呈递增趋势,三者存在显著性差异(P<0.05);NS组、DXM组、榄香烯乳剂组三组caspase-3 m RNA表达也呈递增趋势。4、通过高通量测序,相对于NS组,筛选出榄香烯乳剂组下调的差异mi RNA:hsa-mi R-146b-5p、hsa-mi R-34a-5p、hsa-mi R-574-5p、hsa-mi R-185-5p;RT-PCR验证后进行统计学验证,最终保留hsa-mi R-146b-5p并进行靶基因预测,获得11个可能相关的靶基因:ZNF253、FAM120AOS、RHOBTB3、HSFY1、HSFY2、TRAF6、DIS3L、SYT14、CLLU1、DCAF17、COX6B2。5、支气管镜下可见1例患者榄香烯注射后,气道肉芽组织较前有所吸收;HE染色后光镜下观察,相对于治疗前,治疗后的肉芽组织水肿减轻,成纤维细胞转化为成熟的纤维细胞。结论:1、榄香烯可能通过诱导人类气道原代成纤维细胞凋亡及坏死,抑制其增殖,潜在的机制可能与榄香烯可以上调caspase-3凋亡蛋白和caspase-3m RNA的表达相关。2、榄香烯人类气道对原代成纤维细胞增殖的抑制作用可能与hsa-mi R-146b-5p的下调相关,相关的靶基因包括ZNF253、FAM120AOS、RHOBTB3、HSFY1、HSFY2、TRAF6、DIS3L、SYT14、CLLU1、DCAF17、COX6B2,具体机制有待进一步研究。3、人体内支气管镜引导下气道肉芽组织局部注射榄香烯1例,未见明显不良反应,促进气道肉芽的吸收,为难治性气道狭窄治疗提供新思路。