【摘 要】
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T7噬菌体是一种感染大肠杆菌的烈性噬菌体,基因组为线状双链DNA,全长39 936bp。其衣壳蛋白包括头蛋白P10A、次要头蛋白P10B、颈圈蛋白P8、尾蛋白P11、P12和尾丝蛋白P17。T7噬
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T7噬菌体是一种感染大肠杆菌的烈性噬菌体,基因组为线状双链DNA,全长39 936bp。其衣壳蛋白包括头蛋白P10A、次要头蛋白P10B、颈圈蛋白P8、尾蛋白P11、P12和尾丝蛋白P17。T7噬菌体作为一种常见的展示系统,因其具有载体容量大,插入片段稳定,洗涤条件灵活,生长周期短等优点而被广泛使用。T7噬菌体蛋白芯片是近年来发展起来的一种新的蛋白质检测手段,具有高质量、高灵敏度、高特异性且微型化特点的一种蛋白质分析技术,能使外源蛋白表达并展示于T7噬菌体表面,再将这些展示外源蛋白的T7噬菌体固化在芯片上,对其展示的蛋白进行检测。本试验根据GenBank发表的P11基因序列,设计了一对特异性核苷酸引物,用PCR方法获得598bp大小的基因片段,并将其克隆到表达载体上,测序鉴定,成功构建pET-28a(+)/P11表达载体,转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中,诱导表达重组蛋白P11,并进一步通过Ni-NTA亲合层析柱纯化目的蛋白,纯化率达90%。纯化产物经SDS-PAGE鉴定后免疫Balb/c小鼠,用聚乙二醇PEG介导Balb/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用纯化的P11重组蛋白筛选阳性杂交瘤细胞株,对阳性克隆细胞株经3次有限稀释法克隆化筛选后,最终获得1株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为2G11。对单克隆抗体亚类鉴定结果表明2G11为IgG2b亚类。ELISA试验结果和Western blot分析表明,单抗能与T7噬菌体蛋白和P11蛋白特异结合。这为进一步研究P11蛋白的结构和功能,提高T7噬菌体蛋白芯片的筛选效率以及建立噬菌体检测方法奠定了基础。
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