随着老年人口的增加、视力筛查的普及以及公众的关注度增加,青光眼的患病数逐步增加并成为全球成年人的主要致盲眼疾。青光眼是一种以进行性视网膜神经节细胞死亡为标志的视神经病变,压力依赖性的损伤是其神经病变的主要发病机制之一。青光眼的治疗中以降低眼内压最为重要,此外旨在减轻和挽救受损神经细胞的视神经保护治疗也受到越来越多的重视。广义的视神经保护是指能够防止视网膜神经节细胞发生凋亡的一切治疗手段。已有证据表明,视神经保护可以通过药理学的途径达到。米诺环素(二甲胺四环素)是一种第二代半合成的四环素类广谱抗生素,近来它已被证实可在多种神经退变性疾病模型中表现出神经保护作用。本研究制备了大鼠视网膜神经细胞体外加压培养模型,通过细胞形态学观察、四唑盐(MTT)比色法测定细胞活力来观察米诺环素对上述损伤细胞的保护作用,并应用吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色法检测细胞的凋亡率,免疫细胞化学法观察细胞内iNOS和caspase-3表达的改变,以初步探讨米诺环素对受损细胞保护的可能机制。本研究共分三部分。第一部分压力作用下视网膜神经细胞原代培养模型的建立【目的】建立视网膜神经细胞(retinal neurons ,RNs)的体外加压培养方法,为青光眼的体外实验研究奠定基础。【方法】采用胰酶消化法将生后1-3d的Sprague-Dawley大鼠视网膜制成细胞悬液后,接种于预先置入多聚赖氨酸包被盖玻片的培养瓶中,在37℃、体积分数为5 %的CO2培养箱中培养,并抑制非神经元生长。取部分细胞于培养第3天行抗大鼠MAP2多克隆抗体及抗大鼠THY1.1单克隆抗体免疫细胞化学检查以鉴定RNs和视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)。加压研究分为对照组和加压培养组,加压组正常培养2天后将培养瓶联通自制的压力控制培养系统,在60mmHg(1mmHg=0.133kPa)的压力下培养24h。对照组则不加压,其余条件同实验组。使用倒置显微镜观察细胞的形态,MTT比色法测定两组细胞的活性。【结果】体外培养的视网膜神经细胞生长良好,部分细胞伸出突起,且有些突起相互连接成网。神经节细胞纯度为53.33%。经压力处理后与对照组相比倒置显微镜下形态改变明显,MTT比色法显示细胞活性降低,差异有统计学意义( P < 0.05) ;【结论】RNs的体外加压培养模型能建立成功,经压力处理后的RNs有损伤的改变。第二部分不同浓度米诺环素对加压损伤后的视网膜神经细胞活力的影响【目的】探讨不同浓度米诺环素对体外加压培养视网膜神经细胞损伤的保护作用。【方法】体外培养大鼠视网膜神经细胞,分为对照组,加压组和不同浓度米诺环素处理组(米诺环素浓度由低到高分别为0.002, 0.02, 0.2, 2, 20μmol/L,共5个浓度梯度)。通过细胞形态学观察、MTT比色法测定细胞活性观察不同浓度的米诺环素对上述损伤细胞的保护作用。【结果】与压力损伤组相比,各浓度米诺环素处理组的细胞活性均好于损伤组,且高浓度组好于低浓度组。一定浓度的米诺环素可以减轻压力对细胞的损伤。【结论】米诺环素可促进体外加压培养视网膜神经细胞的生存,对细胞损伤具有明显保护作用。第三部分米诺环素保护加压损伤后视网膜神经细胞的作用机制【目的】探讨米诺环素对压力致视网膜神经细胞损伤的保护作用机制是否涉及对凋亡的抑制。【方法】体外培养大鼠视网膜神经细胞,分为正常对照组、加压损伤组及不同浓度米诺环素处理组(米诺环素浓度由低到高分别为0.002, 0.02, 0.2, 2, 20μmol/L,共5个浓度梯度)。以吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)双染法检测细胞的凋亡指数来观察米诺环素对上述损伤细胞的凋亡情况的影响,然后应用免疫细胞化学法测定细胞内caspase-3和iNOS的表达改变。【结果】压力作用组与对照组相比有大量RNs细胞发生凋亡,各米诺环素处理组使凋亡细胞数量下降,且其效应存在浓度依存性,以0.2–20μmol/L浓度组作用最为明显。加压培养后大鼠视网膜神经细胞中caspase-3和iNOS高效表达,而20μmol/L的米诺环素可明显减少两者的表达。【结论】米诺环素可以抑制压力损伤的大鼠视网膜神经细胞的凋亡,这种抗凋亡作用是它发挥神经保护作用的机制之一。