前言 多胺(polyamine)是一类广泛存在于生物体内的天然脂肪族多价正离子，包括腐胺(putrescine)、精脒(spermidine)和精胺(spermine)，与细胞的增殖、分化、再生以及肿瘤的恶化密切相关。多胺不仅能促进正常细胞的生长，而且对恶性肿瘤细胞的增殖和转移起到促进作用。多胺生物合成限速酶鸟氨酸脱羧酶(Ornithine decarboxylase，ODC)的不可逆抑制剂二氟甲基鸟氨酸(2-difluromethyl ornithine，DFMO)通过临床观察，是一种疗效较好的抗癌药物，尿、血清中的多胺含量作为肿瘤标记物也已在临床应用。 端粒是真核生物线性染色体一种特殊结构，由一简单重复G的DNA序列及蛋白组成，人和各种脊椎动物端粒DNA序列均为(TTAGGG)n，端粒随细胞分裂而不断缩短至一定程度时，细胞将停止分裂，进入老化期，甚至死亡。因此，端粒在细胞衰老和肿瘤增殖中有重要作用。 端粒酶是一种核糖蛋白复合体，包含一个核心RNA和短模板区，可以自身RNA为模板合成端粒重复序列，在恶性肿瘤组织及其脱落细胞中，端粒酶活性检出率较高，而在正常人体细胞中，除生殖细胞和少数造血细胞低水平表达外，端粒酶一般处于失活状态。现已证明端粒酶包括三个主要成份，即人端粒酶RNA(hTR)、端粒酶催化蛋白亚单位(hTERT)和端粒酶相关蛋白(TEP1)。一般认为端粒酶三个组分中hTERT的逆转录活性是端粒酶活性的决定因素。端粒酶在肿瘤的发生，发展中起到重要的作用。端粒酶的激活被认为是恶性肿瘤发生学上的一个共同途径。端粒酶的活性受到各种因素的调节，多胺是否也是通过端粒酶激活这条途径而引起细胞增殖及肿瘤恶化的，是我们的研究所要解决的问题。 本研究利用CAOV3卵巢癌细胞，用不同浓度的腐胺刺激细胞增殖后，’t’run一银染法检测其端粒酶活性，探讨腐胺刺激肿瘤细胞的增殖是否与端粒酶活性有关。通过体内，体外两条不同途径给药，观察腐胺浓度对端粒酶活性调节是直接作用还是间接作用。为进一步探讨多胺与肿瘤的关系提供实验数据。 材料与方法 二．材料 CAOV3细胞系来源于中国医大细胞生物学实验室；肿瘤标本；来源于中国医大附属二院 PCR it；PBR322／Hae皿 DNA Inarer；二甲基亚矾（DMSO）；腐胺；RPMI－1640培养基；小牛血清；引物：h AATCCCTCGAG－CAGAGrt，CX CCC17？ACCCITACCC17ACCCTAA 2．方法 工 1．常规细胞培养：在 37t，5％COZ饱和湿度条件下，用含10％小牛血清的RPMI－1640培养液培养CAOV3细胞系。 2．2．测生长曲线：取对数生长期细胞的 10’个细胞接种于96孔板中，24h细胞贴壁后，加人不同浓度的腐胺继续培养MTh法连续5天测其生长曲线。 2．3 CAOV3细胞端粒酶模板制备：将收集的细胞用PBS洗涤2次，3009离心10ndn，加人裂解缓冲液，160009离心30Inin，取上清一70℃冻存备用。 2．4肿瘤组织端粒酶模板制备：取肿瘤组织100mg用冷的磷酸缓冲液冲洗血液，制成匀浆，加人裂解缓冲液，离心取上清。取sgl测定蛋白含量，其余一70℃冻存备用。 2．STRAP一银染法检测端粒酶活性 ·2· PCR扩增：条件是94℃30秒，50℃30秒，72t分30秒，30 个循环，最后72℃延长10咖。 酚、氯仿抽提，乙醇沉淀。 12％非变性聚丙烯酸胺凝胶电泳。 硝酸银染色：10％冰醋酸中固定，ddHO清洗，0．2％AgNO3染 色，ddHzO清洗，0．02％甲醛刀．28InmchLNQCOs溶液中显色，至 出现清晰条带，用回收的10％冰醋酸固定液终止反应。 2．6凝胶分析系统分析实验结果。 结 果 1．经不同浓度腐胺室温处理2小时后的胃癌组织端粒酶活性 与对照组无显著差异。 2．用不同浓度腐胺室温处理CAOV3细胞提取液二小时后，端 粒酶活性与对照组无显著差异。 3．在细胞培养过程中，外源性增加腐胺浓度可使细胞生长速 度加快。生长速度随腐胺浓度的增加而加快，浓度达500pM时生 长速度最快。 4．CAOV3细胞经不同浓度腐胺处理3天后的端粒酶活性与 对照组相比明显上调。经5见卜M腐胺处理3天3天的细胞端粒 酶活性无显著差异。 讨 论 本研究用不同浓度腐胺处理CAOV3细胞，观察细胞生长速 度，在细胞培养过程中，外源性腐胺浓度增加可使细胞生长速度加 快，证明了多胺在肿瘤发生发展中的重要作用。外源性腐胺对细 胞生长具有促进作用，浓度在500pM时作用最强。 文献报道多胶生物合成抑制可引起Hep－2细胞的增殖抑制 同时伴有端粒酶活性的抑制，补充外源性多胺则端粒酶活性表达 、·3·正常；我们用外源性腐胺作用于CAOV3细胞，检测到端粒酶