目的:骨细胞作为骨组织中机械应力的直接感受器，对维持骨组织的正常功能非常重要。但是应力作用下骨细胞的分子生物学机制还不是十分清楚。本文拟研究不同周期和不同时间的拉伸应变对小鼠MLO-Y4细胞Ca2+及其信号通路的影响，进而探讨拉伸应力对骨细胞的部分作用机制。为进一步研究骨重建机制提供科学理论和实验依据。　　 方法:　　 1、研究选用小鼠骨细胞系MLO-Y4细胞作为研究对象，采用四点弯曲拉伸装置对小鼠骨细胞分别施加应力为:2500με、5000με，频率为0.5Hz，时间:1次/d、1h/次、连续拉伸3d。同时设有加入钙离子抑制剂维拉帕米组(Verapamil)及U73122组，另设0με做为对照组。实验分为:0με(control group)、2500με、5000με、V+2500με、V+5000με、U73122+2500με、U73122+5000με七组。采用MTT实验检测细胞增殖活性，探讨拉伸应变对MLO-Y4细胞增殖活性的影响。　　 2、研究选用小鼠骨细胞系MLO-Y4细胞作为研究对象，采用四点弯曲拉伸装置对小鼠骨细胞分别施加频率为0.5Hz，应力分别为:2500με、5000με，不同时间(1min、3 min、5 min、10 min)的拉伸应变，另设0με(controlgroup)做为对照组，采用荧光分光光度法检测各组细胞的荧光强度值，探讨基底拉伸应变对细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)的影响。　　 3、给MLO-Y4细胞施加频率0.5Hz，应力分别为:2500με、5000με，实验分为:0με(control group)、2500με、5000με、V+2500με、V+5000με、U73122+2500με、U73122+5000με七组，采用荧光标记技术观察2500με、5000με作用下CaM在MLO-Y4细胞的表达;采用荧光分光光度法检测各组细胞的荧光强度值，检测不同应力下CaM的变化;采用Western-blot技术检测CaMKⅡβ、CREB、p-CREB的蛋白表达，探讨拉伸应力对Ca2+-CaM-CaMKⅡβ-CREB信号通路的影响。　　 结果:　　 1、拉伸应变对小鼠MLO-Y4细胞增殖的影响。结果显示:给MLO-Y4细胞施加2500με，频率为0.5Hz，时间:1次/d、1h/次、连续拉伸3d，细胞增殖活性与对照组相比显著增加(p＜0.01);施加5000με，时间与频率不变，细胞增殖活性与对照组相比显著降低(p＜0.05)。　　 2、拉伸应变对小鼠MLO-Y4细胞[Ca2+]i的影响。研究结果证实:给MLO-Y4细胞施加2500με，频率为0.5Hz，拉伸时间分别为:1min、3min、5min，各组[Ca2+]i与对照组(454.5175±31.3695)相比显著升高(p＜0.01)，其中5min组拉伸(566.8609±26.3508)达最高值;当MLO-Y4细胞施加5000με，频率为0.5Hz，拉伸3min(253.2509±30.0641)其[Ca2+]i与对照组相比显著降低(p＜0.01)，1min、3min、5min、10min各组与对照组相比[Ca2+]i均呈下降趋势，其变化趋势与2500με相似，均在作用3min、10min时处于低点。　　 3、拉伸应变对小鼠MLO-Y4细胞CaM表达及活性的影响。结果显示:MLO-Y4细胞有CaM的表达;给MLO-Y4细胞分别施加2500με、5000με，频率为0.5Hz，拉伸时间和周期为1次/d，每次1h，连续3d，2500με作用下CaM活性(399.3518±27.1691)较对照组(237.9961±20.0063)相比显著升高(p＜0.01)，给予钙通道阻滞剂Verapamil及磷脂酶C(PLC)抑制剂U73122后，CaM活性与2500με组相比均显著下调(p＜0.01);5000με作用下与对照组相比CaM活性显著下降p＜0.05）;给予Verapamil及U73122后， CaM活性与5000με组相比均显著下调(p＜0.01)。　　 4、拉伸应变对小鼠MLO-Y4细胞CaMKⅡβ蛋白表达的影响。Western-blot结果显示:MLO-Y4细胞施加2500με，频率及拉伸周期同前，CaMKⅡβ蛋白表达(13.7039±0.6881)较对照组(9.0573±0.4183)相比显著升高(p＜0.01)，加入Verapamil和U73122，CaMKⅡβ蛋白表达均下调(p＜0.01);当细胞施加5000με时，CaMKⅡβ蛋白表达(10.6232±0.6119)与对照组相比显著降低(p＜0.05），加入Verapamil，U73122，CaMKⅡβ蛋白与未加入拮抗剂组相比，表达进一步下调(p＜0.01)。　　 5、拉伸应变对小鼠MLO-Y4细胞CREB和p-CREB蛋白表达影响结果显示:细胞施加2500με、5000με时， CREB蛋白表达与对照组相比差异无统计学意义(p＞0.05）;加入抑制剂Verapamil和U73122后，2500με、5000με组CREB蛋白表达仍无显著变化(p＞0.05）。相同拉伸频率、拉伸时间、2500με组(19.9547±1.5397) p-CREB蛋白表达与对照组(15.2538±1.1189)相比较显著升高(p＜0.01)，加入抑制剂Verapamil(p＜0.01)和U73122(p＜0.05)较2500με组p-CREB蛋白表达均进一步下调;相同条件拉伸5000με与加入抑制剂组比较，抑制剂组蛋白表达也显著下调(p＜0.05）。　　 结论:本研究从细胞内[Ca2+]i、CaM、CaMK、CREB四个环节系统研究了拉伸应变对小鼠MLO-Y4细胞增殖的影响及作用机制研究，发现拉伸应变可以通过[Ca2+]i-CaM-CaMK-pCREB信号通路调控小鼠骨细胞的增殖。　　 1、通过MTT实验证实:生理载荷的拉伸应变可以促进骨细胞增殖，超生理载荷拉伸应变可以抑制骨细胞增殖，细胞内钙及外钙均参与此过程。　　 2、本实验证实:向骨细胞分别施以0.5Hz，2500με、5000με拉伸应力，作用1min、3 min、5min、10min时均发生相应的变化，但变化趋势不同;当细胞施加频率为0.5Hz、2500με作用1min、5min时[Ca2+]i呈上升趋势，5min时[Ca2+]i达到最高，3min、10min呈下降趋势，施加5000με0.5Hz作用1 min、3min、5min、10min[Ca2+]i均下降，3min达到最低点。　　 3、生理载荷的拉伸应变可以促进CaM活性增强，超生理载荷拉伸应变可以抑制CaM活性，内钙及外钙抑制剂均能抑制CaM活性改变。　　 4、生理载荷的拉伸应变可以促进CaMKⅡβ及pCREB蛋白表达，内钙及外钙抑制剂均抑制拉伸应变引发的CaMKⅡβ及CREB蛋白表达。　　 本研究证实:拉伸应变可能通过Ca2+-CaM-CaMK-pCREB信号途调控小鼠MLO-Y4细胞增殖活性。