汞已经成为农田有毒重金属污染的主要来源之一,它在植物中积累会破坏细胞功能,影响植物生长和发育。为了了解汞对植物的毒害作用,我们用1-40μMHgCl2或用20μM HgCl2连续处理紫花苜蓿,研究汞诱导氧化胁迫的机制。组织染色表明在汞胁迫下,紫花苜蓿根的分生区和伸长区均发生明显的膜脂过氧化作用,且膜的完整性受到破坏。根和叶中硫代巴比妥酸反应物质(TBARS)含量的变化证实了这一点。用活性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测脂氧合酶,发现在紫花苜蓿根和叶中分别有两个和三个同工酶,在汞胁迫下变化不尽相同。随着汞浓度的上升,叶片中02-含量及叶和根中H202含量上升,NADH氧化酶的活性上升。为了研究汞胁迫下的生化反应,我们检测了紫花苜蓿中抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD),过氧化物酶(POD),过氧化氢酶(CAT),抗坏血酸过氧化物酶(APX)和谷胱甘肽还原酶(GR)的活性。经汞处理后,紫花苜蓿叶中SOD, POD, APX, GR和CAT总活性上升,根中SOD和POD活性也是上升的。高浓度的汞(40μM)激活根中APX活性,而10-20μM HgCl2抑制了GR活性。活性PAGE分析表明在叶和根中分别检测到了5和3种SOD同工酶,7和10种POD同工酶,8和4种APX同工酶,但汞胁迫下变化不同。仅在叶片中检测到一种CAT带。我们也检测了抗氧化剂如抗坏血酸(ASC)和谷胱甘肽(GSH)的含量,结果表明汞胁迫下,ASC和GSH在根中含量下降,在叶片中积累。我们的研究表明汞胁迫下紫花苜蓿中02-和H202含量上升和抗氧化酶及抗氧化剂含量的变化相关,这些结果不但可以作为土壤受汞污染的生化指示剂,而且可以为研究植物耐汞机制提供重要的理论依据。水杨酸(SA)作为信号分子介导许多生物和非生物胁迫诱导的生理反应。我们研究了SA在调节汞诱导的紫花苜蓿根部氧化胁迫中的作用。用0.2mM SA预处理12h再用10μM Hg2+处理24h后发现,SA能缓解汞对根的毒害,具体表现为降低了根的脂质过氧化产物,促进汞胁迫下根的生长。组织染色进一步证明SA缓解了汞对膜完整性的破坏。SA预处理提高了汞胁迫下的NADH氧化酶,APX和POD的活性,但SOD的活性稍有降低。我们检测了ASC, GSH和脯氨酸含量,发现经SA预处理再用汞处理比仅用汞处理的紫花苜蓿根中积累了更多的ASC, GSH和脯氨酸。所有这些结果表明SA在保护植物抵御汞诱导的氧化胁迫中发挥着重要的作用。microRNAs (miRNAs)是植物和动物中一类调控基因转录后表达的短链、非编码的小分子RNAs (small RNA, sRNA).迄今为止,人们通过生物信息学和实验方法分离和鉴定到了大量的miRNAs,并登录在miRNAs数据库中(http://www.sanger.ac.uk/)。我们用生物信息学的方法从蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)的ESTs和GSS中预测到了新的miRNAs及它们的靶基因。将拟南芥,水稻及其它植物中已知的miRNAs与蒺藜苜蓿ESTs和GSS数据库进行比对的同时,设置一系列严格的筛选标准,分析候选miRNAs序列特征,包括二级结构、茎环长度和miRNAs的保守性,最终筛选出了38个miRNAs.去除已登录的12个,我们在蒺藜苜蓿中一共发现了26个新的miRNAs,它们共代表15个家族。进一步将新鉴定的miRNAs和蒺藜苜蓿mRNA数据库进行比对,预测到了16个靶基因。分析表明上述大多数靶基因编码的产物为转录因子及重要代谢酶类,控制着植物生长发育,信号转导及各种胁迫反应。为了验证预测的正确性,我们用RT-PCR的方法,在蒺藜苜蓿根、茎、叶和花中验证到8个miRNAs,并分析了这些miRNAs在受汞胁迫的叶片中的表达谱。尽管用生物信息学的方法可以分离和鉴定出很多miRNAs,但是其它非保守的miRNAs只有通过直接克隆法才能分离得到。为了获得新的响应胁迫的miRNAs,我们构建了一个经20μM HgCl2处理的蒺藜苜蓿sRNA文库,结果在蒺藜苜蓿中一共克隆到10个新的miRNAs,其中5个为植物中保守序列(1个在上述的生物信息学方法已经预测到),另外5个miRNAs在其它物种中还没有发现,这些miRNAs的生理功能有待于做进一步的鉴定。