猪δ冠状病毒(PDCo V)是近些年来新发现的一种猪肠道冠状病毒,属于套式病毒目、冠状病毒科、δ冠状病毒属成员。2012年,PDCo V于香港首次被发现。2014年,PDCo V在美国大规模爆发和流行。随后,多个国家也报道了该病的发生与流行。PDCo V主要感染新生仔猪,引起腹泻、呕吐、脱水甚至死亡,给养猪业造成了较大的经济损失。最近的研究证实,牛、鸡、小鼠也对PDCo V易感染。而且PDCo V还具有感染人的潜能,对人类与动物健康构成了重大威胁。干扰素(IFN)是宿主抵抗外界病原入侵的重要细胞因子。先前的研究表明,PDCo V感染拮抗I型干扰素产生,从而逃避宿主的抗病毒免疫。然而,PDCo V作为一种肠道病毒,主要感染肠道粘膜组织。有研究表明,在肠道粘膜组织中,Ⅲ型干扰素(IFN-λs)比I型干扰素发挥更重要的抗病毒作用。肠道粘膜上皮细胞能通过上调Ⅲ型干扰素受体的表达和过氧化物酶体的生成,诱导Ⅲ型干扰素应答。然而,为了建立有效的感染,许多病毒采取各种策略来拮抗Ⅲ型干扰素产生。目前,关于PDCo V是否拮抗Ⅲ型干扰素产生尚不清楚。本研究证实PDCo V感染可以拮抗IFN-λ1产生,并进一步研究了其作用机制,主要研究内容如下:1.PDCo V感染拮抗IFN-λ1产生采用IFN-λ1启动子的荧光素酶报告系统和实时荧光定量PCR方法检测PDCo V感染IPI-2I和LLC-PK1细胞后IFN-λ1的表达,结果发现PDCo V感染不能激活IFN-λ1启动子活性和m RNA转录,而且拮抗仙台病毒(Se V)介导的IFN-λ1启动子活性和m RNA转录。这些结果证实PDCo V感染拮抗Ⅲ型干扰素产生。2.PDCo V感染拮抗Se V介导的IRFs和NF-κB的活化IRFs和NF-κB是介导IFN-λ1表达的关键转录因子。为了检测PDCo V感染是否通过抑制IRFs和NF-κB的激活从而拮抗IFN-λ1的产生,采用IRFs和NF-κB介导的IFN-λ1启动子荧光素酶报告系统检测PDCo V感染细胞后IRFs和NF-κB的活化情况。发现PDCo V感染并不能诱导IRFs或NF-κB的激活,并且还抑制了Se V诱导的IRFs和NF-κB激活。这表明PDCo V能通过抑制转录因子IRFs和NF-κB的激活从而拮抗IFN-λ1产生。3.PDCo V感染减少了细胞内过氧化物酶体数量和抑制IRF1的入核先前的研究证实,PDCo V感染可干扰RIG-I样受体(RLR)介导的干扰素产生,并且RLR信号通路也是Ⅲ型干扰素产生的重要途径。因此,推测PDCo V可能通过抑制RLR信号通路上的某些关键信号分子的活性从而拮抗IFN-λ1产生。为了验证这种可能性,通过双荧光素酶活性实验检测PDCo V对RLR信号通路中的关键分子介导的IFN-λ1启动子活性的影响。结果表明,PDCo V可通过靶向RLR信号通路中关键接头蛋白MAVS抑制RLR介导的IFN-λ1启动子活性。过氧化物酶体是Ⅲ型干扰素信号通路的抗病毒信号平台,过氧化物酶体定位的MAVS与Ⅲ型干扰素产生相关。通过间接免疫荧光试验,发现PDCo V感染后细胞内过氧化物酶体的数量显著减少。这些结果进一步佐证了PDCo V通过靶向MAVS抑制IFN-λ1产生。此外,转录因子IRF1的激活在诱导Ⅲ型干扰素产生的过程中具有至关重要的作用,其活化形式是核转位。间接免疫荧光试验结果表明,PDCo V感染抑制IRF1的核转位。这证实PDCo V感染抑制了IRF1的核转位从而拮抗IFN-λ1的产生。4.PDCo V M蛋白拮抗Ⅲ型干扰素产生的初步研究通过IFN-λ1启动子的荧光素酶报告系统筛选了拮抗IFN-λ1产生的PDCo V编码蛋白,发现结构蛋白M具有拮抗IFN-λ1产生的特性。因此,以PDCo V M蛋白为代表,对其拮抗IFN-λ1产生的机制进行了初步研究。双荧光素酶活性实验的结果表明,超表达M蛋白能够抑制RLR通路中关键激酶TBK1及其上游信号分子介导的IFN-λ1启动子激活,但不影响TBK1下游信号分子介导的IFN-λ1启动子激活,提示TBK1可能是M蛋白的作用靶点。同时,通过免疫共沉淀和间接免疫荧光试验,发现M蛋白与TBK1存在相互作用。竞争性免疫共沉淀实验结果进一步证实M蛋白通过与TBK1互作,减弱TBK1与转录因子IRF3的结合,从而抑制IFN-λ1的产生。