研究背景目前,肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球范围内第5大常见癌症,也是造成癌症相关死亡的第3大病因。在我国,HCC的发病率和病死率分别位列第4位和第2位。HCC的发生给患者带来了极大的经济和精神负担,但是临床上HCC的预后仍不尽如人意。究其原因,一方面,虽然目前HCC的治疗在外科切除、肝移植、局部治疗(射频消融(radiofrequency ablation,RFA)、微波消融(microwave ablation,MWA)等方面有很大的发展,但由于治疗方式选择和策略应用缺乏准确性、个体化以及HCC本身侵袭性较强,常合并有肝硬化,即使在根治治疗后,患者的术后5年复发率仍高达70%,生存率低于20%;另一方面,由于早期HCC无明显临床症状,导致相当部分的HCC患者在确诊时已处于疾病晚期,失去了根治机会,仅可接受肝动脉化疗栓塞(transarterial chemoembolization,TACE)、分子靶向药物治疗等姑息治疗方法,疗效甚微。因此,针对HCC患者,如何选择最佳的治疗方式和应用策略,探究更加精准有效的治疗靶点,有待于进一步研究。外科切除是HCC的首选治疗方法,但临床上仅约20%的患者符合切除指征,且由于多数患者合并有肝硬化,肝功能储备较差,外科切除术后是并发症发生率和HCC复发率均较高。RFA是目前最常用的HCC局部治疗方法,2018年美国NCCN肝癌诊疗指南指出:对于≤ 3cm的单个HCC结节,RFA可以作为外科根治性切除的替代疗法。研究发现,RFA对于≤ 2cm的HCC结节的完全消融率高于90%,但随着肿瘤体积的增加,完全消融率迅速下降,导致RFA术后HCC复发率增加。造成这一现象的主要原因是RFA存在的“热沉效应”,即在RFA治疗中,RFA产生的热量被肿瘤及毗邻肝组织血管内的快速血流带走,导致目标区域消融温度下降,降低了 RFA的疗效。对于RFA存在的这一限制,临床上常采用TACE联合RFA疗法治疗HCC。这一联合疗法的优势在于,一方面TACE治疗可栓塞肿瘤区域内的肝动脉,从而降低热沉效应,增加RFA消融温度和范围。另一方面,RFA治疗中所产生的热量可增强TACE的药物抗癌作用。其中,TACE治疗与RFA治疗之间的时间间隔选择,是这一联合治疗的关键策略问题。间隔时间过长,可造成血管再通和新血管生成,一方面会促进热沉效应,从而降低后续RFA的疗效,另一方面再通和血管生成可促进肿瘤转移,影响HCC患者的预后。而间隔时间过短,则可能加重联合疗法对肝功能造成的二次损害,增加术后并发症风险。因此,时间间隔的选择直接关系到联合治疗的疗效,必须选择合理的时间间隔,以在防止血管再通与充分保留肝功能之间取得平衡。然而,目前对于这一关键问题的研究少之又少,亟待进一步研究确定。在HCC局部治疗中,MWA是近年发展较为迅速的一项局部消融治疗方法。MWA依靠组织和血管中的极性分子(主要为水分子)在微波电场的作用下高速摩擦产生热量致肿瘤坏死。与RFA相比,MWA可以在更短的时间达到更高的消融温度和更大的消融范围,且消融效果理论上不受肿瘤附近血管“热沉效应”的影响。因此,MWA可能对HCC中约占三分之一的血管周围HCC的治疗具有潜在的理论优势。血管周围HCC的准确定义为HCC结节与门静脉的第一或第二级分支或肝静脉(直径≥3mm)毗邻。这种毗邻关系导致外科切除和RFA在治疗血管周围HCC时的并发症风险较高、疗效欠佳。然而,由于在MWA治疗过程中快速地形成了一个较大的消融区,肝组织缺血性并发症的发生风险备受关注。目前,临床上MWA治疗血管周围HCC的有效性和安全性还有待研究。HCC患者预后较差的主要原因之一是治疗后易复发,但是目前尚无对于复发HCC治疗方式选择的指南和共识意见。外科再切除和RFA是目前临床上治疗复发性HCC最常用的两种根治性方法。与原发HCC相比,患者确诊复发HCC时肿瘤结节直径一般较小(可能与原发HCC术后随访普遍较规范有关),但复发肿瘤结节数量常为多个。同时,由于患者曾行肝癌外科切除术,复发HCC时肝脏储备功能受限。复发HCC行再切除可能导致残余肝脏体积进一步减少,术后并发症风险高。RFA与再切除相比,患者肝实质损失较少,对肝脏储备功能的影响较小,但是RFA术后HCC潜在再复发风险可能相对较高。目前,对于再切除和RFA治疗复发HCC的疗效和安全性尚不十分清楚。因此,针对复发HCC治疗方式选择的相关研究具有重大的临床意义。尽管外科手术切除是HCC的首选治疗方式,局部介入治疗的疗效也得到了广泛的认可,但仍存在相当部分的HCC患者由于肿瘤分期、肝功能状态等原因,无法接收外科和局部介入手术治疗。对于失去手术根治机会的中晚期HCC患者,分子靶向药物的诞生为其治疗提供了新的选择。在肿瘤的发生发展中,血管生成起着重要的作用,目前已发现多条肿瘤血管生成通路,也相继诞生了多种针对血管生成的分子靶向药物,但是到目前为止,在临床上取得明确疗效的药物少之又少。其主要原因是多数靶向药物的选择性不高,应用无个体化差异。如何寻找更加精准的治疗靶点,筛选、富集优势人群是目前的研究热点。磷酸赖氨酸磷酸组氨酸无机焦磷酸磷酸酶(Phospholysine phosphohistidine inorganic pyrophosphate phosphatase,LHPP)是一种组氨酸磷酸酶。研究发现,组氨酸磷酸酶可通过对含有磷酸组氨酸的蛋白质发挥去磷酸化作用,调节磷脂酰肌3’-激酶(phosphatidylinositol 3’-kinase,PI3K)/蛋白激酶 B(protein kinase B,Akt)等信号通路,进而影响肿瘤组织的血管生成,抑制肿瘤组织生长。最近的研究报道,LHPP在部分HCC患者和造模小鼠的癌组织中的表达明显低于癌旁组织,LHPP在组织中的表达降低是促进HCC形成的重要因素。然而,LHPP对于人HCC组织生长的影响还尚未研究。本研究分四部分,第一部分,首先我们针对原发HCC的治疗策略选择,分析了目前临床上应用较普遍的TACE联合RFA疗法在不同时间间隔下,治疗HCC的疗效和安全性,发现4-5周是TACE联合RFA治疗HCC的理想间隔时间。第二部分,针对原发HCC治疗方式的个体化应用,我们进一步对比了近年来发展较快,普遍认为应用前景较好的MWA疗法与RFA疗法治疗血管周围HCC的疗效和安全性,发现MWA对于门静脉周围的单发肝癌结节患者具有显著的治疗优势。第三部分,针对HCC术后复发率高,相关治疗指南不明确的问题,我们对比了 RFA和外科再切除治疗复发HCC的疗效和安全性,发现RFA对于多发(2-3个)复发HCC结节患者具有显著的治疗优势。第四部分,我们探究了 LHPP在人HCC组织中的表达,及其与患者的临床指标和短期预后的相关性,并运用较前沿的人体组织体外培养技术,探究了 LHPP对于人HCC组织生长的影响,证明了 LHPP对HCC组织生长的抑制作用。本研究为不同类型HCC的治疗策略制定提供了临床依据,同时为HCC的精准无创治疗提供了新的思路。第一部分肝动脉化疗栓塞联合射频消融治疗原发性肝细胞癌的最佳时间间隔研究目的TACE联合RFA已成为一种常用的原发性HCC治疗策略。在该联合疗法的临床应用中,为了在防止血管再通与充分保留肝脏储备功能之间取得平衡,TACE与RFA时间间隔的选择至关重要,但目前还缺少时间间隔相关的研究。本研究旨在探究TACE联合RFA治疗HCC的合理间隔时间。方法1.回顾性纳入TACE联合RFA治疗HCC的患者233例,患者治疗前Child-Pugh分级为A或B,根据TACE和RFA的间隔时间(1-7周)对患者进行分组。2.收集患者的年龄、性别等基本特征信息,以及接受联合治疗前后肝功能Child-Pugh分级和治疗后的肿瘤消融反应(完全缓解、部分缓解、疾病进展和疾病稳定)、并发症和总生存期(overall survival,OS)。3.分析不同时间间隔下,患者接受联合治疗后的肿瘤消融反应,探究时间间隔与消融反应的关系。4.分析不同时间间隔下,患者治疗前后肝功能变化和术后并发症的发生情况,探究时间间隔与肝功能和并发症发生的关系。5.分析不同时间间隔下,患者接受联合治疗后的总生存期,探究时间间隔与总生存期的关系。结果1.肿瘤消融的完全缓解率和总体有效率随着间隔时间的延长而逐渐降低(p<0.05)。2.间隔时间在3周以内的患者,联合治疗1月后Child-Pugh评分明显升高(p<0.01)。其他组患者联合治疗前后Child-Pugh评分无显著提高。3.研究所纳入患者的总体并发症发生率为16.7%,各组并发症发生率无统计学差异(p>0.1)。4.间隔时间为4和5周的两组患者,中位生存期均为42个月,显著高于其他各组(p<0.01)。结论对于Child-Pugh分级A或B的HCC患者,TACE与RFA之间的最佳时间间隔为4-5周。第二部分微波消融和射频消融治疗血管周围原发性肝细胞癌的对比研究目的血管周围HCC在HCC病例中占有相当大的比例,肿瘤相邻的肝内血管可极大得影响HCC治疗的疗效及预后,但目前针对血管周围HCC患者治疗方式选择的推荐意见尚未建立。近年来逐渐应用的MWA被认为具有治疗血管周围HCC的理论优势,本研究旨在对比MWA和RFA治疗血管周围HCC的疗效和安全性。方法1.多中心回顾性收集MWA和RFA治疗的血管周围HCC患者170例,并按照治疗方式不同进行分组:MWA组63例,RFA组107例。2.收集患者的年龄、性别、肿瘤特征和肝功能等基本特征信息并进行倾向评分配对(propensity score-matched,PSM)。3.随访患者消融后的肿瘤消融反应、术后并发症、OS和无进展生存期(progression-free survival,PFS)。4.分别对比总体队列和PSM队列MWA和RFA组的基本特征信息、肿瘤消融反应、术后并发症、OS和PFS。5.按照肿瘤毗邻血管类型(门静脉/肝静脉)和毗邻血管的肿瘤结节数目(单发/2-3个)进行亚组分析。结果1.肿瘤治疗反应对比中,MWA组和RFA组的疾病控制率在总体队列(93.7%vs.90.7%,p=0.492)和 PSM 队列中(92.7%vs.92.7%,p=1.00)中相当。2.MWA 组 1 年、3 年和 5 年的 PFS 分别为 70.5%、55.3%和 52.2%,RFA组为 61.3%、33.2%和 28.1%(p=0.017)。3.MWA组和RFA组的OS在总体队列(p=0.249)和PSM队列(p=0.345)中均无统计学差异。4.MWA组严重并发症发生率明显高于RFA组(27.0%vs.6.5%,p<0.001),但所有严重并发症患者出院前均治愈,无并发症相关的致残或死亡病例。5.亚组分析中,对于门静脉周围HCC患者,MWA组的平均PFS明显优于RFA组(44.9vs.35.8个月,p=0.048)。对于单发血管周围HCC结节,MWA组的平均PFS明显优于RFA组(50.9vs.42.1个月,p=0.014)。结论与RFA相比,MWA可以更好地控制肿瘤进展。对于门静脉周围HCC和单结节性血管周围HCC患者,推荐应用MWA进行治疗。第三部分射频消融和外科再切除治疗复发性肝细胞癌的对比研究目的HCC患者经外科手术切除后5年HCC复发率高达70%。但是,目前对于复发性HCC的治疗方式选择仍不明确。本研究旨在比较RFA和再切除作为复发性HCC一线治疗方式的疗效和安全性,探究复发性HCC的最佳治疗方式。方法1.多中心回顾性收集接受RFA和再切除治疗的外科切除术后复发HCC患者290例,并按照治疗方式不同对病例进行分组:RFA组199例,再切除组91例。2.收集患者的年龄、性别、病因、抗病毒治疗以及原发和复发HCC肿瘤特征、肝功能等特征信息并进行倾向性评分配对(PSM)。随访患者的术后并发症、OS 和 PFS。3.分别对比总体队列和PSM队列RFA组和再切除组的基线特征、术后并发症、OS和PFS。4.按照最大肿瘤长径(≤3cm/3-5cm)、肿瘤结节数目(单发/2-3个)和复发时患者肝功能分级(Child-Pugh A/B)进行亚组分析。结果1.总体队列中,RFA组和再切除组1年、3年和5年OS分别为90.7%、69.04%、55.6%和 87.7%、62.9%、38.1%(p=0.11),RFA 组和再切除组 1 年、3 年和 5年 PFS 分别为 56.5%、27.9%、14.6%和 50.2%、21.9%、19.2%(p=0.80)。2.PSM队列中,RFA组和再切除组1年、3年和5年的OS和PFS也均无组间统计学差异。3.RFA组在严重并发症发生率(0.5%vs.9.1%,p<0.001)、轻微并发症发生率(39.3%vs.94.9%,p<0.001)和患者住院时间(5 vs.14 天,p<0.001)上均优于再切除组。4.亚组分析结果显示,对于2个或3个复发性HCC肿瘤结节的患者,在总体队列和PSM队列中RFA组的OS均明显优于再切除组(p=0.009,p=0.038)。结论总得来看,对于外科切除术后的复发HCC患者,RFA与再切除具有相同的疗效,但RFA术后并发症较少。对于复发性HCC中2个或3个复发肿瘤结节的患者,推荐接受RFA治疗。第四部分组氨酸磷酸酶LHPP对原发性肝细胞癌抑制作用的研究目的探讨LHPP在原发性HCC组织中的表达,及其与患者临床指标和HCC术后复发的相关性,并进一步探究LHPP对人HCC组织生长增殖的影响。方法1.收集临床行外科切除治疗的HCC及癌旁组织60例,同时收集患者的临床病理特征和随访数据。2.利用免疫组织化学(immunochemistry,IHC)、实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和蛋白免疫印记(Western Blot)等试验方法检测LHPP在HCC组织和癌旁组织的表达水平和差异。3.分析LHPP在HCC组织和癌旁组织中的表达与患者临床病理特征和术后HCC复发的相关性。4.在培养的Huh7细胞和HepG2细胞中,分别给予不同浓度(0,1,10,100μg/ml)的LHPP处理。应用cell counting kit-8(CCK-8)试验检测细胞和组织的存活率,探究LHPP对于肝癌细胞系增殖的影响。5.离体培养人HCC组织、癌旁组织,模拟肿瘤在体内的生长状态。分别给予不同浓度(0,1,10,100μg/ml)的LHPP处理。培养一周后,应用CCK-8试验检测组织的存活率,探究LHPP对于人HCC组织生长的作用。结果1.在本研究纳入的60例HCC以及癌旁组织中,IHC结果显示,与癌旁组织相比,LHPP在癌组织中LHPP的低表达率为63.3%,其在HCC组织中的表达显著低于其在癌旁组织中的表达(0.064±0.016 vs.0.078±0.0222,p<0.01)。Western Blot和qRT-PCR试验也发现,LHPP在癌组织中的表达显著低于其在癌旁组织中的表达(p<0.01)。2.LHPP的表达与患者临床病理指标的相关性:LHPP表达与HCC患者存在肝硬化(p=0.003)和门脉癌栓(PVTT)(p=0.036)存在相关性,而与性别、年龄、术前AFP水平、Child-Pugh分级、肿瘤分化程度,肝癌结节大小和数目等无相关(all p>0.05)。3.LHPP的表达与HCC术后复发的相关性:LHPP高表达组患者的无复发生存(recurrence-free survival,RFS)明显优于 LHPP 低表达组(p=0.046)。特别是对于HCC术后短期复发(≤2年),LHPP低表达组发现HCC短期复发患者15例(39.5%),LHPP高表达组发现HCC短期复发患者3例(13.6%),LHPP低表达组的HCC短期复发率显著高于LHPP高表达组(p=0.035)。4.LHPP对于肝癌细胞系的作用:随着LHPP浓度的增加(0,1,10,l00μg/ml)和作用时间的延长,LHPP对于2个肝癌细胞系:Huh7细胞和HepG2细胞的抑制率逐渐升高,且抑制作用明显呈量效关系(p<0.05)。5.在HCC组织和癌旁组织中,给予不同浓度(0,1,10,100μg/ml)的LHPP处理,培养一周后,利用CCK-8测定法检测癌和癌旁肝组织的抑制率。结果显示,与空白对照组相比,LHPP处理的肝癌组织的存活率随着LHPP浓度的增加而降低(p<0.01),不同浓度LHPP处理的癌旁组织的存活率未见明显改变(p>0.05)。结论LHPP在HCC患者癌组织中的表达显著降低,其低表达与肝硬化相关,并提示门脉癌栓和HCC术后复发(特别是短期内复发)的可能,外源性LHPP可明显抑制肝癌细胞系和人HCC组织的增殖和生长。