背景胃癌是目前全世界发病率最高的恶性肿瘤之一,并且在全球肿瘤相关性死亡疾病中排名也相对靠前,据统计约四个肿瘤相关性死亡病例中就有一个来自于胃癌。同时胃癌还具有发病隐匿、恶性程度高、病情进展快、病死率高及预后差等特征。作为胃癌高发区的中国,形势更加严峻,其发病率及病死率均排名第二位。据不全统计,2015年我国胃癌新发病例接近70万,约占全球新发病例的一半;死亡病例超过49万,接近全球死亡病例的3/5。另外我国胃癌还具有早期诊断率低、发病年轻化、手术切除率低、复发转移率高及5年生存率低等显著特征。目前胃癌确切病因尚不完全清楚,研究发现癌基因与抑癌基因异常表达、幽门螺旋杆菌感染、慢性萎缩性胃炎、饮食习惯及环境污染等因素与胃癌发生发展密切相关,其中癌基因活化及抑癌基因失活被认为是导致胃癌发生的关键因素。当前外科手术及放化疗仍然是胃癌主要的治疗手段,但这些治疗手段都具有一定的局限性,导致胃癌的病死率仍然居高不下。面对如此严峻的形势,如何早期诊断及制定合理有效的治疗策略尤为关键。作为与基因异常表达密切相关的疾病,寻找促进胃癌发生发展及判定预后的基因,深入探讨相关机制,对胃癌的诊治及预后评估都具有重要意义。人类DIMT1(DIM1 dimethyladenosine transferase 1 homolog)基因又名HUSSY5及HSA9761,是甲基转移酶超级家族成员之一,于1998年被首次报道。其位于染色体5q12.1,基因全长包含1237个核苷酸,编码的蛋白产物主要位于细胞核,分子量大小约为35kDa。研究表明在幽门螺旋杆菌感染的慢性萎缩性胃炎中,DIMT1表达明显升高,而miRNA210表达明显下降;抑制miRNA210可以上调DIMT1表达,同时还可以促进胃粘膜上皮细胞过度增殖。研究还发现DIMT1与NEDD9,UBC及RIOK2关系密切,而这三个基因又与肿瘤细胞增殖凋亡、侵袭迁移等恶性生物学行为密切相关,同时它们还是监测肿瘤发生与评估预后的重要分子标志物。但是关于DIMT1在胃癌发生发展过程中的作用及相关机制目前国内外文献尚未见报道。本研究首先采用IHC、qPCR及WB技术检测胃癌及配对癌旁组织中DIMT1表达情况,分析DIMT1与胃癌临床病例资料及预后之间的关系;接下来应用基因转染技术从细胞及动物水平研究DIMT1对胃癌恶性生物学行为的影响;最后深入探讨DIMT1影响胃癌恶性生物学行为发展的机制。本研究主要以DIMT1作为分子靶点,探讨其在胃癌恶性生物学行为中所扮演的角色及相关机制,研究主要由以下三个部分构成:第一部分DIMT1在胃癌中的表达及临床意义目的:1.检测DIMT1在胃癌组织、配对癌旁组织及正常胃粘膜组织中的表达水平;2.分析DIMT1与胃癌临床病例资料及预后之间的相关性;3.探讨DIMT1在胃癌监测及临床诊疗中的潜在临床价值。方法:1.通过IHC、qPCR及WB检测DIMT1在75例胃癌及配对癌旁组织和12例正常胃粘膜组织中表达情况;2.采用单因素和多因素Logistic回归分析分析DIMT1与胃癌临床病例资料之间的关系;3.利用Kaplan-Meier生存分析和Log-Rank检验分析DIMT1与胃癌患者术后生存时间的关系。结果:1.DIMT1蛋白主要在细胞核表达,少量位于细胞质,细胞膜不表达,其在癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织及正常粘膜组织;2.DIMT1表达水平与胃癌组织学分化程度、原发病灶浸润深度、区域淋巴结转移数目、远处转移及胃癌临床TNM分期密切相关;与性别、年龄、原发灶肿瘤大小无明显相关性;3.DIMT1高表达胃癌患者术后生存时间显著缩短,DIMT1表达水平与胃癌患者预后呈负相关;4.DIMT1是胃癌患者预后较差的独立危险因素。第二部分DIMT1对胃癌细胞恶性生物学行为的影响目的:1.检测DIMT1 mRNA和蛋白在BGC-823、MKN-45、SGC-790l、MKN-28和GES-1中表达水平,筛选合适的胃癌细胞株进行DIMT1基因沉默和过表达;2.研究DIMT1基因沉默和过表达对胃癌细胞增殖凋亡及侵袭迁移等恶性生物学行为的影响。方法:1.应用IF、qPCR和WB技术检测DIMT1在BGC-823、SGC-7901、MKN-28和MKN-45及GES-1中的表达情况;2.构建DIMT1基因沉默、过表达及对照空载慢病毒,建立DIMT1基因沉默和过表达胃癌细胞株;3.通过EdU增殖和平板克隆实验检测DIMT1对胃癌细胞分化增殖的影响;4.通过流式细胞术检测DIMT1对胃癌细胞凋亡和周期的影响;5.通过细胞划痕修复及Transwell侵袭迁移实验检测DIMT1对胃癌细胞侵袭迁移的影响;6.通过裸鼠皮下成瘤、尾静脉注射及原位种植三种动物模型检测DIMT1对裸鼠体内胃癌细胞增殖凋亡、侵袭迁移及肿瘤新生血管形成的影响;结果:1.IF结果显示:DIMT1主要在胃癌细胞核表达,少量表达于细胞质,其表达强度与胃癌细胞恶性程度呈正相关,在GES-1几乎不表达;2.qPCR和WB结果显示:BGC-823、SGC-7901、MKN-28和MKN-45细胞中DIMT1 mRNA和蛋白表达水平显著高于GES-1;其中BGC-823表达水平最高,其次为MKN-45和SGC-7901,MKN-28最低;3.成功构建DIMT1基因沉默、过表达及空白对照慢病毒,并建立稳定过表达DIMT1的SGC-7901细胞株(SGC-7901-D)和沉默DIMT1的MKN-45细胞株(shMKN-45);4.EdU增殖和平板克隆实验结果显示:与空白对照组及对照组比较,SGC-7901-D细胞分化增殖能力显著增加,shMKN-45细胞分化增殖能力显著减弱;5.流式细胞术结果显示:与空白对照组及对照组比较,SGC-7901-D细胞抗凋亡能力增加,S期细胞比例增加;shMKN-45细胞抗凋亡能力减弱,S期细胞比例下降;6.细胞划痕修复及Transwell侵袭迁移实验结果显示:与空白对照组及对照组比较,SGC-7901-D细胞侵袭迁移能力显著增加,shMKN-45细胞侵袭迁移能力显著减弱;7.动物实验结果显示:与空白对照组比较,SGC-7901-D细胞在裸鼠体内增殖及侵袭迁移速度增快,裸鼠净体重下降;shMKN-45细胞在裸鼠体内增殖及侵袭迁移速度减慢,裸鼠净体重增加。第三部分DIMT1调控胃癌细胞恶性生物学行为机制的研究目的:1.探讨DIMT1调控胃癌细胞恶性生物学行为的分子机制。2.分析DIMT1可能的作用靶点。方法:1.应用第二部分细胞功能学实验研究方法观察基因抑制剂对胃癌细胞增殖凋亡及侵袭迁移的影响;2.应用qPCR和WB技术检测与胃癌增殖凋亡及侵袭迁移相关基因mRNA及蛋白表达水平。结果:1.DIMT1显著上调AKT、p-AKT、MMP2、MMP9及CyclinD1表达水平;2.CDK及MMP2/9抑制剂可以显著抑制胃癌细胞增殖及侵袭迁移;3.AKT抑制剂显著减弱DIMT1上调MMP2、MMP9及CyclinD1表达的能力。结论:1.DIMT1表达水平与胃癌患者预后呈显著负相关,是胃癌患者预后较差的独立危险因素;2.DIMT1通过AKT信号通路上调MMP2、MMP9及CyclinD1表达,促进胃癌细胞增殖、侵袭迁移及肿瘤新生血管形成;3.DIMT1在胃癌中发挥促癌的作用,其可能为胃癌分子靶向治疗提供新的思路,同时还可作为判定胃癌预后的指标。