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随着养猪业规模化的发展,猪病毒性疾病呈现阶段性、暴发性流行,猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)、伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)等7种病毒的单感染或混合感染所引起的传染病成为危害我国规模化养猪业的主要原因,给生猪养殖业带来了巨大的经济损失,严重地制约了我国养猪业的健康发展。而现有的检测手段,无法对感染早期的临床前样本做出准确诊断,容易引起区域性的疫病大爆发。因此,本研究拟通过将磁性微粒病原富集技术、纳米金颗粒病原信号放大技术与荧光探针定量PCR技术有效的结合起来,针对上述病原建立特异性的单重或多重检测和鉴别诊断技术,为猪主要疫病的流行病学筛查与早期防控提供技术支持。首先,在NCBI的Gen Bank库中分别找出上述7种病原代表毒株的全基因组序列,进行同源性分析,找出高度保守序列作为富集探针和放大标签的设计位点,将所设计的富集探针和放大标签分别标记于磁性微粒(MMPs)和纳米金颗粒(AuNPs),然后利用标准毒株建立杂交反应体系,将纳米金上数量庞大的病原特异性标签洗脱下来,利用设计的特异性检测探针MFQ-probe和检测引物进行荧光定量PCR检测,从而将病原信号进行多次放大,检测灵敏度进一步提高,建立起可适用于感染早期样本的纳米-荧光定量超敏检测技术(UNDP-FQ),最后,通过临床样本检验所建立方法的特异性,灵敏性,可重复性和临床应用价值。在此基础上,进一步建立可同时检测CSFV、PRRSV、PCV2、PRV、PPV混合感染的纳米-荧光定量超敏规模化检测技术(UNDP-MFQ)。研究取得以下结果:1. 建立分别针对CSFV、PRRSV、PCV2、PRV、PPV、PEDV和TGEV的纳米-荧光定量超敏检测技术(UNDP-FQ)。根据上述7种病毒的高度保守区域,设计了14个富集探针分别标记于MMPs,以及14个放大标签分别标记于AuNPs,形成功能化的磁微粒和纳米金颗粒,通过功能化的MMPs富集病原核酸信号,功能化的AuNPs放大病原信号,特异性MFQ-probe荧光定量PCR检测放大信号标签,确定了7组特异性富集探针和放大标签,用于建立针对7种病毒的UNDP-FQ检测体系。特异性检测试验显示,所建立的分别针对7种病原的特异性UNDP-FQ检测方法只能特异性地检测到目标病原,不与其它病原发生交叉反应;灵敏度检测试验显示,UNDP-FQ检测方法是普通Real-time PCR检测方法的10~2～10~3倍;针对7种病原三个浓度梯度血清样本的组内重复试验和组间重复试验结果显示,组内重复和组间重复的最大变异系数(C.V)均小于1%,说明所建立的UNDP-FQ检测方法重复性良好,检测体系中试剂在4 ~oC存放6个月能够具有良好的稳定性。在此基础上,将建立的7种病原特异性的UNDP-FQ检测方法应用于临床血清或粪便样本检测时发现,UNDP-FQ检测方法总体上显示出比常规Real-time PCR检测法更高的诊断准确性,尤其对于未表现临床症状或体征、处于临床前期感染阶段的样本,UNDP-FQ的阳性检出率显著高于常规Real-time PCR。2. 针对引起猪繁殖障碍性病毒病的5种主要病原,本研究在特异性UNDP-FQ检测技术建立的基础上,通过对病原特异性核酸标签的改建和加入相对应的病原特异性的Taqman探针来进一步提升检测体系的特异性,建立了同时检测CSFV、PRRSV、PCV2、PRV、PPV混合感染的纳米-荧光定量超敏规模化检测技术(UNDP-MFQ)。首先经UNDP-MFQ反应体系检测筛选,确定了用于建立完整反应体系的富集探针和放大标签,在同一反应体系中可同时检测上述5种病原的UNDP-MFQ。特异性检测试验显示,在5 种病原富集探针和放大标签同时存在情况下,只有目标病原存在时,UNDP-MFQ检测体系才会在相应病原放大信号特异性的Taqman探针荧光定量PCR显示阳性扩增曲线,不同病原之间不会出现交叉反应;灵敏度检测试验显示,针对5种病原的UNDP-MFQ最低检测限为20 copies/m L的标准血清混合样本,是普通多重Real-time PCR检测方法的5×10~3倍;重复性试验结果显示,UNDP-MFQ检测方法的组内、组间的变异系数均小于1.5%,说明所建立的UNDP-MFQ检测方法重复性良好,检测体系中试剂在4 ~oC存放6个月能够具有良好的稳定性。此外,将UNDP-MFQ进行临床应用时,UNDP-MFQ检测方法总体上显示出比常规多重Real-time PCR法更高的诊断准确性,尤其对于未表现临床症状或体征、处于临床前期感染阶段的样本,UNDP-MFQ的检出率和检测准确性显著高于常规多重Real-time PCR,并且可以在一次反应中对血清样本中的5种病原同时进行检测,且无需病原核酸提取和反转录过程。本研究中针对7种猪常见病原分别建立了特异性UNDP-FQ,在此基础上,针对猪繁殖障碍性疾病早期诊断与筛查需求建立了同时可检测5种常见病原的UNDP-MFQ检测技术,UNDP-FQ和UNDP-MFQ检测技术具有无需病原核酸提取过程,灵敏度高,特异性强,可重复性好等技术优点,可用于临床前期带毒动物的诊断,提高临床前期样本的阳性检出率,能为猪重大疫病病原的早期、快速、高通量检测、鉴别诊断提供技术支持,从而减少生猪养殖中的经济损失,为猪主要疫病临床前期的规模化筛查提供了一套可行的技术方法。