肺癌已成为全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,全球每年新发肺癌病例已达1.2亿,因肺癌死亡人数约为1亿人/年,肺癌已逐渐成为严重威胁人类生命健康的主要杀手之一。手术是肺癌的最佳治疗手段,但多数患者就诊时已属中晚期,丧失手术切除机会,放化疗仍是目前肺癌的主要治疗手段,尽管各种治疗手段不断改进和完善,肺癌的5年生存率也仅为17%左右,所以发现新的治疗药物和治疗策略改善肺癌患者的生存率成为目前亟待解决的问题。榄香烯是从传统中草药姜科植物温郁金中提取出来的,它是由β-榄香烯、γ-榄香烯和δ-榄香烯组成的混合物,其中β-榄香烯占榄香烯混合物的60%-72%,也是榄香烯抗肿瘤的主要作用成分。β-榄香烯具有广谱、毒副作用轻、不易产生耐药等突出优点,被广泛用于肺癌、消化道肿瘤、脑瘤以及其他浅表性肿瘤的治疗。研究证实β-榄香烯主要通过诱导肿瘤细胞凋亡产生抗肿瘤作用,同时也有少数报道显示其可提高肿瘤细胞的放射敏感性。但β-榄香烯诱导细胞凋亡及提高肿瘤细胞放射敏感性的具体机制仍不十分清楚,有待于进一步深入研究。本研究分别观察β-榄香烯联合X射线照射对肺腺癌A549细胞和肺鳞癌H520细胞DNA损伤及其修复和端粒酶活性的影响。同时,对β-榄香烯诱导A549细胞凋亡的分子机制进行深入探讨,旨在为中药β-榄香烯的临床应用提供有价值的实验室依据。目的:1、通过碱性及中性彗星实验观察β-榄香烯联合X射线照射对肺腺癌A549细胞和肺鳞癌H520细胞DNA损伤及其修复的影响。2、采用TRAP-PCR-银染法研究β-榄香烯联合X射线照射对肺腺癌A549细胞和肺鳞癌H520细胞端粒酶活性的影响。3、观察β-榄香烯对A549细胞凋亡的影响,通过β-榄香烯对A549细胞溶酶体膜通透性、线粒体膜电位及细胞内氧化应激水平影响的研究,进一步探讨β-榄香烯诱导肺腺癌A549细胞凋亡的分子机制。方法:第一部分:β-榄香烯联合X线照射对肺癌细胞株DNA损伤及其修复的影响1、实验分组:根据处理不同,将A549细胞和H520细胞各分为四组:(1)对照组:只接受RPMI 1640培养基处理;(2)β-榄香烯组:β-榄香烯(终浓度5、10和20μg/ml)37℃作用24h;(3)照射组:6MV-X线单次剂量4 Gy照射;(4)β-榄香烯联合照射组:5、10和20μg/ml的β-榄香烯作用24h后予4 Gy单次剂量照射。2、照射后立即进行碱性彗星实验和中性彗星实验,观察β-榄香烯联合X射线照射对A549细胞和H520细胞DNA单链断裂(SSB)及DNA双链断裂(DSB)的影响。3、照射后将细胞置于37℃孵箱中分别孵育2h、6h、24h后再进行碱性彗星实验和中性彗星实验,观察β-榄香烯联合X射线照射对A549细胞和H520细胞SSB及DSB损伤修复的影响。第二部分:β-榄香烯联合X线照射对肺癌细胞株端粒酶活性的影响1、实验分组:根据处理不同,将A549细胞和H520细胞各分为四组:(1)对照组:只接受RPMI 1640培养基处理;(2)β-榄香烯组:20μg/ml的β-榄香烯37℃作用24h;(3)照射组:6MV-X线单次剂量4 Gy照射;(4)β-榄香烯联合照射组:20μg/ml的β-榄香烯作用24h后予4 Gy单次剂量照射。2、A549细胞和H520细胞经上述相应处理后,将细胞置于37℃孵箱中继续孵育24h,然后通过TRAP-PCR-银染法观察β-榄香烯联合X线照射对A549细胞和H520细胞端粒酶活性的影响。第三部分:β-榄香烯诱导A549细胞凋亡的分子机制探讨1、采用MTT比色法测定不同浓度β-榄香烯对肺腺癌A549细胞和肺鳞癌H520细胞的抑制率。2、不同浓度β-榄香烯(终浓度为5,10,20μg/ml)分别作用A549细胞12h、24h和36h后通过彗星试验检测细胞DNA损伤,荧光显微镜观察凋亡细胞形态,流式细胞仪检测细胞凋亡率及对caspase-3活性的检测,证实细胞凋亡的发生。3、采用对溶酶体敏感的吖啶橙(AO)荧光染色剂,通过荧光分光光度计及共聚焦荧光显微镜技术检测5,10和20μg/ml的β-榄香烯在不同时间点(12h、24h和36h)对A549细胞溶酶体膜通透性的影响;通过Western Blot检测溶酶体释放的组织蛋白酶D(cathepsin D)在细胞浆中的表达,以进一步证实β-榄香烯可诱导A549细胞溶酶体膜通透性增加;采用罗丹明123(Rhodamine123)荧光染色剂通过荧光分光光度计检测β-榄香烯在不同时间点对A549细胞线粒体膜电位的影响。4、通过2’7’-二氢二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)和苯二醛(OPT)分别测定不同浓度β-榄香烯对A549细胞内活性氧自由基(ROS)以及还原性谷胱甘肽(GSH)含量的影响,证实β-榄香烯可以诱导A549细胞氧化应激的产生。5、利用cathepsin D蛋白特异性的抑制剂抑胃肽A(50μM)预处理A549细胞24h,然后与20μg/ml的β-榄香烯共同孵育细胞24h或36h,观察其对线粒体膜电位及细胞凋亡的影响,证实溶酶体及其释放的cathepsin D在β-榄香烯诱导的凋亡中发挥重要作用。结果:第一部分1、β-榄香烯单独作用24h后可导致A549和H520细胞产生拖尾,β-榄香烯组彗星尾矩与对照组比较具有统计学意义(P<0.05),提示β-榄香烯单药可导致细胞SSB及DSB损伤产生。2、A549和520细胞经不同处理后立即进行碱性和中性彗星实验,榄香烯联合照射组的彗星尾矩与单独照射组以及单独药物组相比有所增加,差别有统计学意义(P<0.01),提示β-榄香烯与X线联合作用可以增加细胞SSB及DSB损伤。3、A549和H520细胞经不同时间修复后再进行碱性和中性彗星实验, A549细胞修复2h后,单独照射组的彗星拖尾现象消失,彗星尾矩与对照组比较无统计学意义(P>0.05),也就是说SSB及DSB损伤得以修复。而H520细胞修复6h后,照射组拖尾现象才消失,说明SSB及DSB损伤6h才得以修复,提示4 Gy的X射线所造成的放射损伤在A549细胞中比在H520细胞中更易修复。4、A549细胞经不同时间修复后,联合处理组具有较明显的SSB及DSB损伤残留,与单独照射组以及单独药物组的彗星尾矩比较具有统计学意义(P<0.01),提示β-榄香烯可抑制A549细胞SSB及DSB损伤的修复。H520细胞中,β-榄香烯与射线联合可明显抑制H520细胞DSB的修复,但照射后6h和24h的结果显示,β-榄香烯与射线联合所造成的SSB与单独β-榄香烯组比较无统计学意义(P>0.05),提示β-榄香烯可能对H520细胞的SSB损伤修复无抑制作用。第二部分1、银染观察β-榄香烯单药处理组的条带与对照组比较颜色变浅,提示β-榄香烯可抑制A549和H520细胞的端粒酶活性。2、A549细胞单独照射组条带颜色较对照组有所增加,而H520细胞单独照射组条带颜色较对照组变浅,提示4 Gy的X射线照射诱导A549细胞端粒酶活性增加,但却抑制H520细胞端粒酶活性。3、β-榄香烯与X射线联合处理组的条带与单独照射组及单独药物组比较均明显变浅,提示β-榄香烯与X射线联合处理可显著抑制A549细胞和H520细胞的端粒酶活性。第三部分1、通过MTT实验及计算求得β-榄香烯作用A549细胞24h的IC50值为152.64μg/ml,作用H520细胞24 h的IC50值为72.86μg/ml。2、β-榄香烯作用A549细胞24h可引起细胞DNA损伤,但此时未见凋亡发生;当β-榄香烯作用时间延长至36h时,细胞凋亡率及caspase-3活性显著增加,呈现明显剂量依赖关系。3、β-榄香烯作用A549细胞12h,细胞内AO荧光强度和胞浆内cathepsin D蛋白表达明显增加,说明β-榄香烯作用A549细胞12h可引起溶酶体膜通透性增加,此时未见细胞线粒体膜电位的明显改变。β-榄香烯作用时间延长至24h,A549细胞线粒体膜电位开始下降,证实溶酶体膜通透性的增加早于线粒体膜电位的改变。4、β-榄香烯作用细胞24h可导致A549细胞内DCF荧光强度显著增加,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),说明β-榄香烯可引起细胞内ROS的产生。在同样的实验条件下检测A549细胞内GSH含量,结果显示:β-榄香烯作用细胞24h可导致细胞内OPT荧光信号显著减弱,即GSH含量明显下降。5、抑胃肽A预处理可明显抑制20μg/mlβ-榄香烯所导致的A549细胞DNA损伤、线粒体膜电位下降以及细胞凋亡的发生。结论:第一部分1、β-榄香烯单药作用可以导致A549和H520细胞SSB及DSB损伤的形成。2、β-榄香烯与X射线联合作用可以增加A549和H520细胞SSB及DSB损伤,推测增加细胞DNA的损伤可能是其增加细胞放射敏感性的作用机制之一。3、4Gy的X线所造成的SSB及DSB损伤在A549细胞中2h即可修复,在H520细胞中需要6h,说明A549细胞具有较快的DNA损伤修复速率和较强的DNA损伤修复能力,这可能是肺腺癌放射抵抗的原因之一。4、β-榄香烯与X射线联合作用可以明显抑制A549细胞和H520细胞SSB及DSB损伤的修复,推测β-榄香烯可能通过抑制细胞DNA损伤的修复提高肿瘤细胞的放射敏感性。第二部分1、β-榄香烯单药可以显著抑制A549和H520细胞的端粒酶活性。2、4Gy的X线照射可以诱导A549细胞端粒酶活性增加,但却能使H520细胞端粒酶性下降,诱导端粒酶活性增加可能是肺腺癌放射抵抗的原因之一。3、β-榄香烯和X射线联合作用与单独照射组和单独药物组相比可以显著抑制A549和H520细胞的端粒酶活性,提示β-榄香烯可能通过抑制细胞端粒酶活性增加肿瘤细胞的放射敏感性。第三部分1、β-榄香烯对A549和H520细胞具有不同的抑制率,证实不同的肿瘤细胞对β-榄香烯的敏感性不同。2、β-榄香烯作用A549细胞24h可引起细胞DNA损伤,但此时未见凋亡发生;36h后可引起细胞凋亡的产生。3、β-榄香烯作用A549细胞12h即可导致溶酶体膜通透性增加,24h后可引起细胞线粒体膜电位的显著下降,由此可见,溶酶体膜通透性的改变(12h)早于细胞线粒体膜电位下降(24h)和细胞凋亡的发生(36h)。4、β-榄香烯可引起A549细胞内ROS产生增加以及GSH含量的显著下降,从而产生氧化应激反应。5、用抑胃肽A预处理A549细胞,可以明显抑制A549细胞DNA损伤、线粒体膜电位的下降以及细胞凋亡的产生。由此可见,溶酶体及溶酶体释放的cathepsin D在β-榄香烯诱导的A549细胞凋亡中发挥了重要作用。