论文部分内容阅读
肝纤维化(liver fibrosis)是由多种原因引起的慢性肝损伤的病理变化。它的特点是肝脏中细胞外基质(extracellulaur matrix, ECM)的过度积累,肝脏的生理功能受损。肝纤维化的病因十分复杂,多种致病因素引起的慢性肝病都可以发展为肝纤维化,如病毒、酒精、药物及毒物等。肝纤维化发病机理与肝脏的炎症反应,氧化应激,肝细胞的凋亡,以及肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的活化等有关。肝纤维化治疗效果欠佳,越来越普遍并且引起广泛重视。纳曲酮(Naltrexone, NTX)是羟吗啡酮的N-环丙甲基衍生物,为外源的吗啡受体拮抗剂,与阿片受体亲和力很强,远大于吗啡和脑啡肽,对3种吗啡受体(μ-,δ-,K-)均有拮抗作用,能竞争性阻断并取代吗啡样物质与受体结合及清除吗啡类药物中毒征象。纳曲酮可以在吗啡受体与毒品之间起到屏障作用,已经被用于酗酒和吗啡类药物依赖的治疗。纳曲酮无依赖性,然而,长期使用会导致肝脏发生病理性改变,引起肝损伤、肝纤维化,严重者可导致肝硬化甚至肝癌。三七是我国一种传统中药,其中三七皂苷(Panax Notoginseng, PTS)是三七的主要生物活性成份,具有活血化淤、抗氧化、抑制细胞内Ca2+内流等作用。在调节肝功能方面,三七具有改善肝脏微循环、调节血糖、降低血液中胆固醇和血脂、清除自由基、保护线粒体、内质网等细胞器,抑制肝脏中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原以及转化生长因子1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)的合成,在抵抗肝纤维化甚至肝癌等方面发挥重要作用。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是机体内一个比较大的酶家族,在机体内发挥着至关重要的作用。通常MMPs发挥生理作用时需要Ca2+、Zn2+等金属离子的辅助。胶原主要是由细胞外基质(extracellular matrixc,ECM)堆积产生的,而MMPs几乎能降解所用的ECM,在肝脏中,MMPs与胶原的分解有着密切的关系。当然,MMPs的生理作用还有很多,比如坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障,控制肿瘤细胞的侵袭和转移等。在MMPs家族中,MMP-2是分布最为广泛的酶。硫氧还蛋白-1(thioredoxin-1, Trx-1)是一种具有多种生理功能的小分子蛋白,广泛存在于原核生物和真核生物中,主要的功能就是它的氧化还原调节功能,除此之外,硫氧还蛋白-1还具有调节细胞周期、抑制凋亡、调节炎症反应等诸多作用。本文采用吗啡受体拮抗剂纳曲酮(Naltrexone, NTX)分别作用人肝癌细胞(Human Hepatoma Cell Line, HepG2)以及C57BL/6品系小鼠,构建慢性肝损伤、肝纤维化的细胞模型和动物模型,探索纳曲酮引起肝损伤、肝纤维化的分子机制,以及三七皂苷在抵抗纳曲酮引起的肝损伤、肝纤维化过程中所发挥的生物学作用。进一步明确三七皂苷通过诱导硫氧还蛋白-1抵抗肝损伤和肝纤维化的机制。主要研究结果：纳曲酮(Naltrexone,NTX)剂量依赖性地降低了HepG2细胞的活力,同时,HepG2细胞在形态学上也发生了显著性的变化。与凋亡相关的Pro-caspase-9、 Pro-caspase-3、Bcl-2的表达呈下降趋势,Bax、细胞色素C(Cytochrome C, Cyt C)的表达呈升高趋势。在这个过程中,Trx-1的表达呈降低趋势。而三七皂苷的加入有效地回复了HepG2细胞的活力,并且对Pro-caspase-9、Pro-caspase-3以及Trx-1的降低有着显著的抑制作用。在小鼠实验中,我们将6-8周龄的雄性C57BL/6小鼠随机分成4组,分别为对照组、纳曲酮组、三七皂苷+纳曲酮组和三七皂苷组,每组10只,对照组灌胃生理盐水,纳曲酮组灌胃纳曲酮,三七皂苷+纳曲酮组在灌胃纳曲酮的同时腹腔注射三七皂苷的生理盐水溶液,三七皂苷组腹腔注射三七皂苷的生理盐水溶液,持续处理三个月后取血液和肝组织。研究发现纳曲酮组血液中谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、谷草转氨酶(aspertate aminotransferase, AST)浓度显著性高于对照组,而三七皂苷+纳曲酮组血液中的ALT、AST的浓度相比纳曲酮组又有一定的回复作用；同样,肝组织切片的HE染色结果显示,纳曲酮组的小鼠肝组织有明显的坏死,而三七皂苷+纳曲酮组有一定的回复作用。与此同时,在纳曲酮组的肝组织中,我们通过Western blot险测到与肝纤维化发生和发展相关的基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)、转化生长因子1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的表达呈升高趋势,而Trx-1的表达呈下降趋势,并且三七皂苷的加入有效地抵抗的这些蛋白的表达变化。因此,三七皂苷能有效地抵抗纳曲酮引起的慢性肝损伤、肝纤维化,并且这一调节作用很可能是通过诱导Trx-1的高表达来实现的。总结：Trx-1在三七皂苷抵抗纳曲酮引起的肝损伤、肝纤维化中起重要的作用,Trx-1很有希望成为治疗慢性肝损伤、肝纤维化的重要靶点。