由条形柄锈菌（Puccinia striiformis f. sp. tritici）引致的小麦条锈病是一种气传性真菌病害,在全世界小麦种植区域均有不同程度发生。在我国,小麦条锈病发生、危害十分严重,已成为影响小麦生产可持续发展的限制因素。国内外的研究、实践证明,选育和种植抗病品种是防治小麦条锈病最经济、有效、安全的措施。因而,小麦抗条锈病机制以及小麦与条锈菌互作机理等方向的研究一直是植物抗病性及其利用领域中的研究热点。然而,由于条锈菌是专性寄生菌,且尚未发现其有性时代,加之小麦基因组庞大复杂,限制了对该病害的深入系统研究。因此,从转录组水平上全面系统了解小麦与条锈菌互作的基因表达特征,克隆抗条锈相关基因并利用病毒诱导的基因沉默技术分析其功能,为阐明小麦与条锈菌互作的分子机理奠定基础,并为小麦抗条锈性的合理利用和小麦抗条锈性的遗传改良及条锈病的持久控制提供理论依据和技术支撑。本文以小麦品种水源11分别与条锈菌条中CY31和CY23构成的亲和与非亲和组合为材料,采用cDNA-AFLP技术对其进行表达谱分析,同时分离差异表达的TDF（transcripts-derived fragment）;利用qRT-PCR技术验证cDNA-AFLP表达谱以及分析重要基因的表达特征;通过PCR筛选文库和RACE方法,克隆蛋白激酶、病程相关蛋白及与HR（hypersensitive reaction）相关的基因,并通过生物信息学分析基因的基本特性;运用BSMV-VIGS（virus induced gene silencing）技术对候选基因进行了初步的功能分析。主要研究内容及结果如下:1.分别在小麦接种条锈菌后6 h、12 h、18 h、24 h、36 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h及168 h取样,抽提总RNA,反转录合成cDNA,然后利用cDNA-AFLP进行差异表达谱分析;利用64对引物检测到亲和与非亲和组合中表达的TDFs分别为54,912和52,992个,其中的33对引物具有较好的多态性。在亲和组合中,2,306个TDFs的表达谱发生了改变（占表达谱的4.2%）,呈上调表达的有1,340个TDFs,下调表达的有966个TDFs。在非亲和组合中约2,437个TDFs表达受到抑制或促进（占表达谱的4.6%）,其中1,787个TDFs呈上调表达,650个TDFs的表达受到抑制。亲和组合与非亲和组合分别回收215个和300个TDFs,经克隆、测序和聚类分析后,亲和组合unigenes为186个,非亲和组合unigenes为255个。利用GO分类方法分别对两个组合的unigenes进行功能注释,两个组合的ESTs均分为14大类,包括代谢、能量、细胞生长、转录、蛋白质合成、蛋白质储藏与运输、转运子、胞内运输、细胞结构、信号转导、疾病与防御、转座、功能未知以及没有匹配的序列。数据分析发现,亲和与非亲和组合中分别有60%和56%的ESTs功能未知或者为No hits;两个组合中,差异表达的基因以基础代谢、信号及抗病类为主,表明小麦与条锈菌互作时,基础代谢以及信号传导等相关基因转录活跃,寄主通过加快自身的代谢以及积累更多的营养物质,以满足自身及小麦条锈菌专性寄生的需要,同时也会启动一系列信号途径响应病原菌的侵染。2.分别从亲和及非亲和文库中挑选部分基因进行qRT-PCR分析,以验证cDNA-AFLP技术的准确性。研究结果表明,基因的表达趋势与cDNA-AFLP表达谱基本一致,并且大部分基因均受条锈菌诱导表达。说明利用cDNA-AFLP分析小麦与条锈菌互作的基因表达谱及分离差异表达的基因是可行的。3.以非亲和差异表达TDFs文库中的unigenes为Qurey方,用BLASTN搜索亲和互作数据库DB-TDFs进行比对分析。结果发现,两个组合中共有161条ESTs序列相似性很高,94条非亲和组合中的ESTs序列在亲和组合中没有匹配或相似性很低,它们编码的产物涉及基础代谢、信号与抗病反应及蛋白质代谢等各功能分类。对两个组合中相似性较高及没有匹配的部分ESTs片段进行了qRT-PCR分析,结果表明:大部分基因在亲和互作及非亲和互作中均受诱导表达,但在两个组合中表达的强度和启动表达的时间有所不同。由qRT-PCR分析的结果并结合cDNA-AFLP的表达谱可推测,在小麦与条锈菌互作体系中,基因表达的种类在亲和与非亲和互作中基本一致,基因表达的强度与时间的不同可能是引致寄主植物抗病性变化的因素之一。4.利用PCR筛选cDNA文库方法,获得了5个激酶类基因,分别暂命名为TaRLK（2393 bp）,TaCIPK（1993 bp）,TaLRR-RLK（2272 bp）,TaSTK（1831 bp）,TaCDPK（1441 bp）。它们分别编码受体激酶（684 aa）,CBL互作蛋白激酶（439 aa）,LRR-受体激酶（605 aa）,丝氨酸/苏氨酸激酶（433 aa）和钙依赖蛋白激酶（342 aa）;InterProScan分析表明,它们所编码的蛋白具有蛋白激酶的活性位点,属于激酶类基因,且TaRLK,TaCIPK,TaSTK三个蛋白的磷酸化作用需依赖ATP,TaCIPK具有该蛋白家族特有的NAF基序,NAF编码25个氨基酸,主要调控TaCIPK与钙调磷酸酶B（CBL）的相互作用;TargetP预测发现,TaRLK及TaLRR-RLK类受体激酶编码蛋白具有N端信号肽,可能是分泌蛋白质;Tmpred分析表明,TaCIPK和TaLRR-RLK编码的蛋白具有跨膜区;经Psort预测,TaRLK,TaCIPK,TaLRR-RLK蛋白分布在质膜的可能性较大,TaCDPK则可能位于细胞质,而TaSTK蛋白可能分布在过氧化物酶体或细胞核;氨基酸比对及进化树分析表明,TaRLK,TaCDPK,TaCIPK,TaLRR-RLK及TaSTK分别与小麦（Triticum aestivum,AAK20741）、水稻（Oryza sativa,BAD53576）、大麦（Hordeum vulgare,ABQ09285）、玉米（Zea mays,NP₀01147794）、大麦（H. vulgare,ABF18544）等激酶具有很高相似性;qRT-PCR分析表明,在转录水平上,TaSTK在小麦与条锈菌互作中的表达变化不显著,其余四个基因在互作早期均受条锈菌诱导表达,并且与亲和组合相比,这四个基因在非亲和互作中表达的强度较大,而且启动时间要早。结果表明,在小麦与条锈菌互作的早期,TaRLK,TaCDPK,TaCIPK及TaLRR-RLK转录产物迅速积累,可能参与了小麦对条锈菌的抗病反应,而TaSTK是否在转录后或翻译水平调控小麦与条锈菌互作需要进一步研究。5.采用BSMV-VIGS技术,对16个差异表达的激酶类基因进行功能分析。结果显示,11个发生基因沉默的小麦接种条锈菌CY23后症状表型发生了不同程度的变化（野生型接种条锈菌表现为抗病反应,表型为0;）,且组织学观察的结果与其表型变化基本一致。其中Su11_CY31₄885、Su11_CY31₅766、Su11_CY23_C304（TaCIPK）、Su11_CY23₂159（TaSTK）、Su11_CY23_C90等5个基因沉默后,过敏性坏死面积较大,仅有少量夏孢子产生,反应型为1+型;Su11_CY31₁189、Su11_CY31_C193（TaRLK）、Su11_CY31₃468、Su11_CY23₂780等4个基因的转录产物受到抑制后,枯死面积相对较小,并在褪绿斑周围产生少量夏孢子堆,反应型为2型,但对条锈菌CY23仍表现为抗病反应;而基因Su11_CY31₂485和Su11_CY31₁437的转录产物被沉默后,小麦对CY23的反应型,由0;转变为3+反应型,即由非亲和反应转变为亲和反应。以上结果表明:Su11_CY31₄885、Su11_CY31₅766、Su11_CY23_C304、Su11_CY23₂159、Su11_CY23_C90、Su11_CY31₁189、Su11_CY31_C193、Su11_CY31₃468及Su11_CY23₂780等基因参与小麦对条锈菌CY23的抗性反应,但对条锈菌的抗性贡献较小,而Su11_CY31₂485和Su11_CY31₁437两个基因在水源11对条锈菌CY23的抗病反应中起着重要作用。6.利用PCR筛选cDNA文库及RACE方法,获得了TaPR1b（862 bp）、TaPR5（810 bp）和TaPR10b（975 bp）三个病程相关蛋白基因,分别编码164、173、166个氨基酸;TMpred预测发现,TaPR1b、TaPR5、及TaPR10b蛋白均不含跨膜区。SignalIP 3.0预测TaPR1b蛋白的前24个氨基酸和TaPR5蛋白的前20个氨基酸是典型的信号肽结构,TaPR10b蛋白没有信号肽。另外,Psort预测显示,TaPR1b、TaPR5蛋白可能是胞外蛋白,而TaPR10b可能是胞质蛋白。在转录水平上,TaPR1b、TaPR5、及TaPR10b基因均受条锈菌诱导表达,且在亲和与非亲和组合中的表达变化趋势基本一致,只是在表达强度上,非亲和组合高于亲和组合。在12 hpi（Hour post inoculation）,基因转录达到第一次表达高峰,在24 hpi-72 hpi,三个基因的表达相对稳定,在120 hpi出现第二次表达高峰,且强度均高于第一次。以上结果表明TaPR1b、TaPR5、及TaPR10b基因参与了小麦与条锈菌互作体系中的基础防御反应,只是在非亲和组合中它们对条锈菌抗性的贡献要大。而在120 hpi,三个病程相关蛋白基因的表达强度高于第一次表达高峰,表明由于在此阶段大量次生菌丝会产生更多的吸器,从而引发更强烈的小麦应激反应,同时也暗示吸器在条锈菌与小麦互作中的重要作用。另外,外源SA、JA和ET处理小麦叶片后,qRT-PCR的研究结果表明,TaPR1b、TaPR5、及TaPR10b基因表达对SA和JA比较敏感,在早期即被诱导表达,并保持较高表达水平。而对ET的诱导表现不敏感。因此,它们可能主要通过SA和JA信号途径参与了小麦对条锈菌的抗性反应。洋葱表皮亚细胞定位表明,融合蛋白TaPR5-hGFP在非原生质体中高强度表达。TaPR5的免疫细胞化学标记结果显示:超薄切片经TaPR5抗体孵育和山羊抗鼠免疫球蛋白-胶体金标记后,胶体金颗粒主要沉积于寄主细胞壁上,亲和组合中寄主细胞壁上胶体金颗粒的密度远低于非亲和组合。寄主细胞质和细胞器上几乎无标记的金颗粒,病菌细胞没有金颗粒分布。表明TaPR5参与了小麦对条锈菌的抗性反应。7.通过PCR筛选cDNA文库及RACE方法克隆了TaBI-1（1095 bp）、TaDAD2（608 bp）、TaPrx（689 bp）、TaELMO（1146 bp）和TaLLS（1786 bp）等与HR相关基因的全长,并利用生物信息学方法明确了它们的分类地位;小麦与条锈菌互作过程中的表达特征分析显示,它们参与了小麦与条锈菌的互作过程;另外,外源SA和JA诱导TaPrx、TaELMO基因的表达,TaBI-1、TaDAD2和TaLLS在SA及JA诱导下,表达变化不显著,而五个基因对ET诱导均不敏感,表明它们通过不同的信号途径参与小麦对条锈菌的互作过程。利用VIGS进行功能分析的结果显示:TaBI-1和TaDAD2基因分别发生沉默后,再接种条锈菌CY23,小麦叶片过敏性坏死反应面积较对照和γ病毒接种CY23后的明显减少,且坏死斑周围有少量夏孢子产生,表明TaBI-1和TaDAD2参与了小麦对条锈菌的抗性反应,并且可能是小麦与条锈菌HR反应的负调控子。而TaLLS沉默后的小麦叶片过敏性坏死的数量明显减少,表明TaLLS可能是HR反应的正调控因子。