盐碱、干旱和低温是影响植物生长和作物产量的重要环境因素。植物在长期进化过程中发展了多种分子机制以应对不同胁迫压力。当植物受到逆境胁迫时,一些蛋白质可被诱导产生以减轻胁迫所造成的伤害。植物胚胎发育晚期丰富蛋白(Late embryogenesis abundant protein,LEA)是与细胞抗逆保护相关的一类重要蛋白质。LEA蛋白通常分为6组。其中,第一组LEA(LEA1)蛋白高度保守,不仅存在于植物中,而且在动物和细菌中也被发现。LEA1蛋白还具高亲水性,推测LEA1蛋白可作为水结合蛋白或缓冲液来调节细胞中水的状态,对受脱水胁迫的细胞起保护作用。已有一些遗传学实验证明LEA1蛋白的表达可提高转基因植物的耐盐性。然而,LEA1蛋白的抗逆保护机制仍不清楚。本研究克隆了编码大豆(Glycine max. L)Em(LEA1)蛋白的基因,全长序列包含氨基端、中部和羧基端三个保守基序区域。首先将全长Em蛋白基因及三个结构域(Em-N、Em-2M和Em-C)基因片段转入大肠杆菌,研究其在500mM NaCl和500mM KCl培养基上的存活率。结果表明,不仅全长序列Em蛋白基因的转入可以提高重组菌的耐盐性,而且三个结构域基因片段的转入也可以提高重组菌的耐盐性。其耐盐能力顺序为:Em>Em-C≈Em-2M>Em-N。然后,将全长Em蛋白基因和Em-2M结构域基因片段导入酵母菌中,研究其在1500mM NaCl和700mM MgCl2培养基中的生长状况。结果表明,全长Em蛋白基因的转入可以提高重组酵母的耐盐性,Em-2M基因片段的转入同样可以提高重组酵母的耐盐性。两者赋与酵母的耐盐能力相近。我们进一步将全长Em蛋白基因和Em-2M结构域基因片段转入高等模式植物----拟南芥中,研究其在150mM NaCl培养基上的种子萌发率及在125mM NaCl培养基上幼苗根的生长状况。结果表明,全长Em蛋白基因的转入可以提高转基因拟南芥的耐盐性,Em-2M基因片段的转入也可以提高转基因拟南芥的耐盐性。因此,大豆Em蛋白及其保守结构域可以提高大肠杆菌、酵母和拟南芥对高盐胁迫的耐受性。体外实验中,我们研究了大豆Em蛋白及其结构域多肽对蛋白质(酶)的保护作用。对冻融胁迫下LDH酶的活性、蛋白聚集和ANS荧光分析结果表明,大豆Em蛋白及其结构域多肽可阻止LDH酶失活、聚集和结构改变,且三个方面的保护能力表现一致:Em>Em-C>Em-2M>Em-N。因此,大豆Em蛋白及三个结构域多肽通过稳定LDH酶结构、阻止LDH酶聚集而保护LDH酶活性。同时,圆二色谱(CD)分析显示,Em-N多肽具有形成高比例α螺旋结构的潜能;Em、Em-2M和Em-C多肽同时存在着α螺旋和多聚脯氨酸II型(PII)结构。为进一步研究α螺旋和PII结构对Em蛋白保护功能的贡献,我们通过点突变方法构建了五个Em-2M突变体和一个Em-N突变体,获得了具有不同α螺旋和PII结构含量的系列突变多肽。对上述突变多肽的CD分析结果表明,Em蛋白中至少存在两个PII结构,一个位于第53位到第61位氨基酸之间,另一个位于羧基端结构域内。然后,我们分析了突变多肽对冻融胁迫下LDH酶活性的保护能力。结果表明,与Em-2M比较,当突变多肽中不存在PII结构时,尽管其形成α螺旋潜能增强,对酶活性保护能力下降;与Em-N相比较,当突变多肽中形成PII结构后,尽管其形成α螺旋潜能下降,保护能力增强。这些结果表明PII结构在多肽的酶活性保护功能中发挥重要作用。此外,与Em-2M相比,突变多肽仍存在PII结构的情况下,当形成α螺旋潜能下降时保护能力下降;当形成α螺旋潜能增强时保护能力增强。这进一步表明,在PII结构存在时,多肽的LDH酶活保护能力与其形成α螺旋的潜能线性相关。综上所述,不仅大豆Em蛋白基因、而且Em蛋白保守结构域的表达也可赋与大肠杆菌、酵母及拟南芥对高盐的耐受性,意味着在进化上高度保守的LEA1蛋白可能以类似的作用机制保护经逆境胁迫的原核和真核细胞。LEA1蛋白对细胞的保护作用,可通过该蛋白质形成的PII结构与α螺旋的共同作用,实现对细胞中蛋白质(酶)活性的保护及对蛋白质结构的稳定。