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目前,牙槽骨缺损或骨量不足的患者,尤其是伴有2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)等骨代谢障碍的患者,种植体骨结合差、种植修复失败率高的问题已引起广泛关注。利用干细胞通过骨组织工程技术解决骨代谢障碍患者牙槽骨缺损问题、促进其种植体骨结合是近年来的研究热点。其中,脂肪间充质干细胞(Adipose-derived stem cells,ADSCs)以其来源丰富、易获取、不受伦理学制约等得天独厚的优点而成为该领域的“明星干细胞”。但有研究表明,受其固有属性影响,ADSCs倾向于成脂分化而成骨分化能力较弱。因此,提高ADSCs成骨分化能力是解决上述问题的关键。脑信号蛋白Semaphorin 3A(Sema3A)参与并正向调控骨代谢平衡,能促进成骨细胞及其前体细胞(如ADSCs)成骨,是一种极具应用前景的骨保护因子。本研究利用Sema3A重组蛋白处理小鼠ADSCs,重点观察Sema3A促进ADSCs成骨分化的时间效应,并通过相关体外实验分析Notch信号通路在其中发挥的作用,以期探明Sema3A促进ADSCs成骨分化的可能机制,为其最终用于临床工作、改善上述患者群种植体骨结合状况提供科学研究基础。【目的及意义】通过观察Sema3A对ADSCs成骨分化的促进作用及其时间作用模式,并借助Notch信号通路特异性阻断剂γ-分泌酶抑制剂(Gamma-secretase inhibitor,GSI)分析Notch信号通路在其中所扮演的角色,探索Sema3A促进ADSCs成骨分化的可能机制,为其在口腔种植领域的临床应用提供实验依据。【方法】1.Ⅰ型胶原酶消化法分离、培养C57BL/6小鼠ADSCs,并通过形态学观察、多向分化诱导和表面分子标志物检测对分离培养的细胞进行鉴定。2.利用q PCR,Western Blot和免疫荧光染色等方法,观察Sema3A及其受体Nrp1(Neuropilin-1)在ADSCs成骨分化过程中的表达变化;利用q PCR检测成骨相关基因、茜素红染色检测钙结节形成、ALP染色检测ALP活性等方法,观察Sema3A对ADSCs成骨的促进作用,重点关注其时间作用模式以及Sema3A对ADSCs干性的改变和成骨分化的启动作用。3.用GSI阻断Notch信号通路后,通过q PCR和Western Blot检测其对ADSCs干性的影响;利用q PCR检测Notch信号通路相关分子在ADSCs成骨分化过程中的变化趋势,并通过q PCR检测成骨相关基因以及ALP染色检测ALP活性、天狼星红染色检测胶原分泌、茜素红染色检测钙结节形成等方法观察GSI作用下成骨诱导7,14和21d时的成骨效果。以q PCR和免疫荧光染色的方法观察Sema3A重组蛋白作用下,ADSCs对Notch信号通路相关分子表达的变化。成骨诱导过程中,联合应用Sema3A重组蛋白与GSI,观察成骨效果。【结果】1.成功获得具有多向分化潜能的ADSCs。2.ADSCs本身及其成骨分化全过程中均表达Sema3A及其受体Nrp1,且Sema3A在成骨初期表达明显上调,之后逐渐降低、于成骨末期恢复到初始水平;而Nrp1表达水平始终保持恒定。Sema3A重组蛋白能促进ADSCs的成骨分化,且Sema3A作用时间越长、作用阶段越早,作用效果越明显。Sema3A能直接降低ADSCs干性、启动生长培养基中的ADSCs成骨分化。3.GSI阻断ADSCs中Notch信号通路后,ADSCs中干性相关基因表达降低。ADSCs中表达的Notch信号通路相关分子主要有Notch2,Jagged2,Hes1;ADSCs成骨分化早期,上述各分子表达明显下调。在ADSCs成骨分化早期用GSI处理7d可以增强ADSCs成骨分化,延长处理时间至14-21d则抑制ADSCs成骨分化。4.Sema3A重组蛋白可以降低ADSCs对Notch信号通路相关分子的表达;同单独应用Sema3A或GSI处理相比,成骨初期同时用Sema3A重组蛋白和GSI进行干预,不能进一步促进ADSCs成骨分化。【结论】1.Sema3A及其受体参与ADSCs成骨分化的全过程,其促进作用在成骨分化早期尤为明显,这种作用甚至是启动性的。2.Sema3A对ADSCs成骨分化的促进作用可能是通过降低ADSCs中Notch信号,进而降低ADSCs干性而实现的。