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乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，死亡率在所有恶性肿瘤中占第二位。其中，雌激素受体（Estrogen Receptor，ER）阳性型乳腺癌占70%左右。他莫昔芬（Tamoxifen，TAM）自1970年被发现以来一直作为绝经前ER阳性早期乳腺癌内分泌治疗的首选药物。尽管如此，仍有约20-30%的ER阳性早期乳腺癌病人在治疗期间因他莫昔芬耐药出现乳腺癌的局部复发或远处转移，导致临床内分泌治疗的失败。现有的研究结果并未充分有效的解决临床上他莫昔芬耐药的机制和克服问题。
表观遗传调控是除遗传突变外引起肿瘤耐药的重要机制。EZH2（Enhancer of Zeste Homolog2）蛋白是表观遗传学中转录抑制物多梳阻遏蛋白的一个催化亚基，可使组蛋白H3上第27位赖氨酸（H3K27）发生三甲基化。因此它具有组蛋白甲基转移酶的活性，并作为转录抑制因子发挥作用。研究表明，EZH2在乳腺癌细胞中呈高表达状态；沉默EZH2基因可抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭能力和肿瘤球的形成，并可上调ER的表达水平和增加细胞对抗雌激素治疗的敏感性。因此，EZH2可能成为临床阻断或逆转乳腺癌他莫昔芬耐药的新靶标分子。
为探索EZH2作为乳腺癌他莫昔芬耐药治疗的新靶标分子的可能性，本研究首先检测了EZH2在乳腺癌原发灶和他莫昔芬耐药引起的复发转移灶组织之间、乳腺癌亲本细胞株MCF-7和他莫昔芬耐药细胞株TamR MCF-7之间表达的差异，然后通过观察EZH2对两株细胞的增殖、侵袭、凋亡以及对他莫昔芬的敏感性等生物学功能的影响，初步探索了EZH2调控乳腺癌细胞他莫昔芬耐药的分子机制。
第一章 EZH2在他莫昔芬耐药的乳腺癌组织和细胞中的表达
方法：
1．收集标本：40例ER阳性、HER-2阴性早期乳腺癌并接受初始他莫昔芬治疗满2年出现局部复发或远处转移的患者的肿瘤原发灶标本和匹配的复发或转移灶穿刺活检标本。
2．细胞培养：乳腺癌亲本细胞株MCF-7和他莫昔芬耐药细胞株TamR MCF-7。
结果：
1．EZH2在他莫昔芬耐药引起的复发转移灶癌组织中的表达水平显著高于乳腺癌原发灶。
2．与乳腺癌亲本细胞株MCF-7相比，EZH2mRNA和蛋白表达在他莫昔芬耐药细胞株TamR MCF-7中显著上调。
第二章 EZH2对他莫昔芬耐药的乳腺癌细胞增殖、侵袭、凋亡及他莫昔芬敏感性的影响
方法：
1．将重组质粒pcDNA3.1-EZH2和pcDNA3.1-空载质粒转染到MCF-7细胞中，将EZH2siRNA和阴性对照siRNA转染到TamR MCF-7细胞中，构建EZH2过表达细胞株（MCF-7）和沉默细胞株（TamR MCF-7）；采用qRT-PCR和Western blotting技术验证细胞转染效果。
2．克隆形成实验检测EZH2过表达细胞株（MCF-7）和沉默细胞株（TamR MCF-7）的克隆形成能力。
3．Transwell实验检测EZH2过表达细胞株（MCF-7）和沉默细胞株（TamR MCF-7）的侵袭能力。
结果：
1．qRT-PCR及Western blotting结果显示，MCF-7细胞中EZH2过表达组（pcEZH2）的EZH2mRNA和蛋白的表达量均明显高于过表达对照组（pcNC）（p＜0.05）；TamR MCF-7细胞中EZH2沉默表达组（siEZH2）的EZH2mRNA和蛋白的表达量明显低于沉默对照组（siNC）（p＜0.05）。
2．克隆形成实验结果显示，MCF-7细胞中pcEZH2组的细胞克隆形成数（70.6±6.98）显著高于pcNC组（30.6±4.98）（p＜0.05）。TamR MCF-7细胞中siEZH2组的细胞克隆形成数（17.2±4.15）显著低于与siNC组（41.6±4.83）（p＜0.05）。
3．Transwell侵袭实验结果显示，MCF-7细胞中pcEZH2组的侵袭细胞数（141.8±9.83）显著高于pcNC组（85.8±8.90）（p＜0.05）。TamR MCF-7细胞中siEZH2组的侵袭细胞数（41.6±8.17）显著低于siNC组（98.8±8.56）（p＜0.05）。
4．流式细胞术结果显示，MCF-7细胞中pcEZH2组的细胞凋亡率（12.39±2.20%）显著低于pcNC组（21.45±2.56%）（p＜0.05）。TamR MCF-7细胞中siEZH2组的细胞凋亡率（28.27±3.11%）显著高于siNC组（17.89±2.73%）（p＜0.05）。
5．细胞增殖-毒性实验结果显示，乳腺癌MCF-7细胞中EZH2基因过表达后，在他莫昔芬浓度为2、8和32μM时其耐药性显著提高（p＜0.05）；TamR MCF-7细胞中EZH2基因沉默后，在他莫昔芬浓度为2和8μM时其耐药性显著降低（p＜0.05）。
结论：
EZH2过表达显著增强MCF-7细胞的克隆形成及侵袭能力，抑制细胞凋亡，降低乳腺癌细胞对他莫昔芬敏感性以增强其耐药性。EZH2沉默抑制TamR MCF-7细胞的克隆形成及侵袭能力，促进细胞凋亡，增强乳腺癌细胞对他莫昔芬敏感性以降低其耐药性。
第三章 EZH2调控乳腺癌细胞他莫昔芬耐药的分子机制
方法：
1．利用生物信息学软件TargetScan和PicTar预测筛选EZH2上游的潜在miRNA，进行实验验证。
2．qRT-PCR法检测预测的靶miRNA在MCF-7和TamR MCF-7细胞中的表达。同时检测乳腺癌组织中miR-101的表达，与EZH2mRNA表达进行相关性分析。
3．合成miR-101inhibitor和inhibitor NC并分别将其转染至MCF-7细胞中，合成miR-101mimics和mimics NC并分别将其转染至TamR MCF-7细胞中，细胞增殖-毒性实验检测转染细胞对他莫昔芬的敏感性变化。
4．qRT-PCR以及Western blotting方法检测转染细胞中EZH2mRNA和蛋白表达的变化。
5．构建pmiGLO/EZH2-3’UTR和pmiGLO/EZH2-3’UTR mut质粒载体。采用荧光报告载体实验验证EZH2是否为miR-101的直接靶基因。
6．统计学分析：实验数据采用均数?±标准差表示，然后使用GraphPad Prism8.0.2软件进行分析。Student’s t检验用于组间差异的比较。以p＜0.05作为差异有统计学意义的标准。
结果：
1．利用生物学信息网站TargetScan和PicTar成功预测EZH2上游的潜在miRNA，最后选择8种miRNA：hsa-miR-124-3p、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-144-3p、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-137、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-506-3p和hsa-miR-217。
2．qRT-PCR结果显示，hsa-miR-124-3p、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-144-3p、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-137、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-506-3p及hsa-miR-217在TamR MCF-7细胞中表达水平均不同程度低于MCF-7细胞（p＜0.05）。其中，hsa-miR-101-3p的表达量下降最明显（降低约78.5%）。遂对miR-101是否参与EZH2对乳腺癌细胞他莫昔芬耐药的调控做进一步研究。
3.qRT-PCR结果显示，乳腺癌复发转移癌组织中miR-101的表达较原发灶显著降低（p＜0.05）。相关性分析发现miR-101和EZH2mRNA表达之间呈显著负相关。
4．细胞增殖-毒性实验结果显示，MCF-7细胞转染miR-101inhibitor后，在他莫昔芬浓度为2、8、32μM时，相对于对照组（inhibitor NC），其耐药性显著提高（p＜0.05）。TamR MCF-7细胞转染miR-101mimics后，在他莫昔芬浓度为2和8μM时，相对于对照组（mimics NC），其耐药性显著降低（p＜0.05）。
5．qRT-PCR和Western blotting结果显示，MCF-7细胞中miR-101inhibitor组的EZH2mRNA和蛋白的表达量均明显高于inhibitor NC组（p＜0.05）；TamR MCF-7细胞中miR-101mimics组的EZH2mRNA和蛋白的表达量明显低于mimics NC组（p＜0.05）。
6．荧光报告载体实验显示，miR-101能够与EZH2基因mRNA3UTR的特定位点结合并抑制EZH2基因的表达。
结论：
1．他莫昔芬耐药的乳腺癌组织中miR-101的表达较原发灶显著降低，相关性分析发现miR-101和EZH2mRNA表达之间呈显著负相关。
2．miR-101能够下调他莫昔芬耐药的乳腺癌细胞EZH2的表达，并增强其对他莫昔芬的敏感性。
3．miR-101能够与EZH2基因mRNA3UTR的特定位点结合并抑制EZH2基因的表达，证明EZH2是miR-101的直接靶基因。
表观遗传调控是除遗传突变外引起肿瘤耐药的重要机制。EZH2（Enhancer of Zeste Homolog2）蛋白是表观遗传学中转录抑制物多梳阻遏蛋白的一个催化亚基，可使组蛋白H3上第27位赖氨酸（H3K27）发生三甲基化。因此它具有组蛋白甲基转移酶的活性，并作为转录抑制因子发挥作用。研究表明，EZH2在乳腺癌细胞中呈高表达状态；沉默EZH2基因可抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭能力和肿瘤球的形成，并可上调ER的表达水平和增加细胞对抗雌激素治疗的敏感性。因此，EZH2可能成为临床阻断或逆转乳腺癌他莫昔芬耐药的新靶标分子。
为探索EZH2作为乳腺癌他莫昔芬耐药治疗的新靶标分子的可能性，本研究首先检测了EZH2在乳腺癌原发灶和他莫昔芬耐药引起的复发转移灶组织之间、乳腺癌亲本细胞株MCF-7和他莫昔芬耐药细胞株TamR MCF-7之间表达的差异，然后通过观察EZH2对两株细胞的增殖、侵袭、凋亡以及对他莫昔芬的敏感性等生物学功能的影响，初步探索了EZH2调控乳腺癌细胞他莫昔芬耐药的分子机制。
第一章 EZH2在他莫昔芬耐药的乳腺癌组织和细胞中的表达
方法：
1．收集标本：40例ER阳性、HER-2阴性早期乳腺癌并接受初始他莫昔芬治疗满2年出现局部复发或远处转移的患者的肿瘤原发灶标本和匹配的复发或转移灶穿刺活检标本。
2．细胞培养：乳腺癌亲本细胞株MCF-7和他莫昔芬耐药细胞株TamR MCF-7。
结果：
1．EZH2在他莫昔芬耐药引起的复发转移灶癌组织中的表达水平显著高于乳腺癌原发灶。
2．与乳腺癌亲本细胞株MCF-7相比，EZH2mRNA和蛋白表达在他莫昔芬耐药细胞株TamR MCF-7中显著上调。
第二章 EZH2对他莫昔芬耐药的乳腺癌细胞增殖、侵袭、凋亡及他莫昔芬敏感性的影响
方法：
1．将重组质粒pcDNA3.1-EZH2和pcDNA3.1-空载质粒转染到MCF-7细胞中，将EZH2siRNA和阴性对照siRNA转染到TamR MCF-7细胞中，构建EZH2过表达细胞株（MCF-7）和沉默细胞株（TamR MCF-7）；采用qRT-PCR和Western blotting技术验证细胞转染效果。
2．克隆形成实验检测EZH2过表达细胞株（MCF-7）和沉默细胞株（TamR MCF-7）的克隆形成能力。
3．Transwell实验检测EZH2过表达细胞株（MCF-7）和沉默细胞株（TamR MCF-7）的侵袭能力。
结果：
1．qRT-PCR及Western blotting结果显示，MCF-7细胞中EZH2过表达组（pcEZH2）的EZH2mRNA和蛋白的表达量均明显高于过表达对照组（pcNC）（p＜0.05）；TamR MCF-7细胞中EZH2沉默表达组（siEZH2）的EZH2mRNA和蛋白的表达量明显低于沉默对照组（siNC）（p＜0.05）。
2．克隆形成实验结果显示，MCF-7细胞中pcEZH2组的细胞克隆形成数（70.6±6.98）显著高于pcNC组（30.6±4.98）（p＜0.05）。TamR MCF-7细胞中siEZH2组的细胞克隆形成数（17.2±4.15）显著低于与siNC组（41.6±4.83）（p＜0.05）。
3．Transwell侵袭实验结果显示，MCF-7细胞中pcEZH2组的侵袭细胞数（141.8±9.83）显著高于pcNC组（85.8±8.90）（p＜0.05）。TamR MCF-7细胞中siEZH2组的侵袭细胞数（41.6±8.17）显著低于siNC组（98.8±8.56）（p＜0.05）。
4．流式细胞术结果显示，MCF-7细胞中pcEZH2组的细胞凋亡率（12.39±2.20%）显著低于pcNC组（21.45±2.56%）（p＜0.05）。TamR MCF-7细胞中siEZH2组的细胞凋亡率（28.27±3.11%）显著高于siNC组（17.89±2.73%）（p＜0.05）。
5．细胞增殖-毒性实验结果显示，乳腺癌MCF-7细胞中EZH2基因过表达后，在他莫昔芬浓度为2、8和32μM时其耐药性显著提高（p＜0.05）；TamR MCF-7细胞中EZH2基因沉默后，在他莫昔芬浓度为2和8μM时其耐药性显著降低（p＜0.05）。
结论：
EZH2过表达显著增强MCF-7细胞的克隆形成及侵袭能力，抑制细胞凋亡，降低乳腺癌细胞对他莫昔芬敏感性以增强其耐药性。EZH2沉默抑制TamR MCF-7细胞的克隆形成及侵袭能力，促进细胞凋亡，增强乳腺癌细胞对他莫昔芬敏感性以降低其耐药性。
第三章 EZH2调控乳腺癌细胞他莫昔芬耐药的分子机制
方法：
1．利用生物信息学软件TargetScan和PicTar预测筛选EZH2上游的潜在miRNA，进行实验验证。
2．qRT-PCR法检测预测的靶miRNA在MCF-7和TamR MCF-7细胞中的表达。同时检测乳腺癌组织中miR-101的表达，与EZH2mRNA表达进行相关性分析。
3．合成miR-101inhibitor和inhibitor NC并分别将其转染至MCF-7细胞中，合成miR-101mimics和mimics NC并分别将其转染至TamR MCF-7细胞中，细胞增殖-毒性实验检测转染细胞对他莫昔芬的敏感性变化。
4．qRT-PCR以及Western blotting方法检测转染细胞中EZH2mRNA和蛋白表达的变化。
5．构建pmiGLO/EZH2-3’UTR和pmiGLO/EZH2-3’UTR mut质粒载体。采用荧光报告载体实验验证EZH2是否为miR-101的直接靶基因。
6．统计学分析：实验数据采用均数?±标准差表示，然后使用GraphPad Prism8.0.2软件进行分析。Student’s t检验用于组间差异的比较。以p＜0.05作为差异有统计学意义的标准。
结果：
1．利用生物学信息网站TargetScan和PicTar成功预测EZH2上游的潜在miRNA，最后选择8种miRNA：hsa-miR-124-3p、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-144-3p、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-137、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-506-3p和hsa-miR-217。
2．qRT-PCR结果显示，hsa-miR-124-3p、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-144-3p、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-137、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-506-3p及hsa-miR-217在TamR MCF-7细胞中表达水平均不同程度低于MCF-7细胞（p＜0.05）。其中，hsa-miR-101-3p的表达量下降最明显（降低约78.5%）。遂对miR-101是否参与EZH2对乳腺癌细胞他莫昔芬耐药的调控做进一步研究。
3.qRT-PCR结果显示，乳腺癌复发转移癌组织中miR-101的表达较原发灶显著降低（p＜0.05）。相关性分析发现miR-101和EZH2mRNA表达之间呈显著负相关。
4．细胞增殖-毒性实验结果显示，MCF-7细胞转染miR-101inhibitor后，在他莫昔芬浓度为2、8、32μM时，相对于对照组（inhibitor NC），其耐药性显著提高（p＜0.05）。TamR MCF-7细胞转染miR-101mimics后，在他莫昔芬浓度为2和8μM时，相对于对照组（mimics NC），其耐药性显著降低（p＜0.05）。
5．qRT-PCR和Western blotting结果显示，MCF-7细胞中miR-101inhibitor组的EZH2mRNA和蛋白的表达量均明显高于inhibitor NC组（p＜0.05）；TamR MCF-7细胞中miR-101mimics组的EZH2mRNA和蛋白的表达量明显低于mimics NC组（p＜0.05）。
6．荧光报告载体实验显示，miR-101能够与EZH2基因mRNA3UTR的特定位点结合并抑制EZH2基因的表达。
结论：
1．他莫昔芬耐药的乳腺癌组织中miR-101的表达较原发灶显著降低，相关性分析发现miR-101和EZH2mRNA表达之间呈显著负相关。
2．miR-101能够下调他莫昔芬耐药的乳腺癌细胞EZH2的表达，并增强其对他莫昔芬的敏感性。
3．miR-101能够与EZH2基因mRNA3UTR的特定位点结合并抑制EZH2基因的表达，证明EZH2是miR-101的直接靶基因。