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在动物体内，干细胞持续更新分化产生的各类型终末分化细胞对维持组织器官的功能有着至关重要的作用。哺乳动物睾丸中的精原干细胞(SSCs)持续分化产生精子这一过程贯穿于雄性个体生长发育的整个时期，可以说SSCs是种系维持和遗传进化的一个桥梁和枢纽。SSCs不仅可作为再生性治疗的优良种子细胞，也是成体干细胞研究的良好体外模型。微小RNA (microRNAs)在多种组织器官细胞的基因调控中发挥重要的作用，包括细胞自我更新、分化、增殖及凋亡，同样也是干细胞的重要调控因子。miR-34家族中的miR-34c，在细胞内的多个过程中都有作用，对精子发生过程也有重要的调控作用。Nanos是一类进化保守的RNA结合蛋白，在生殖细胞发育中发挥功能，包括原始生殖细胞和生殖干细胞。在小鼠中，Nanos2在SSCs中表达，在精子发生过程中具有维持干细胞多能性的作用。本研究以miR-34c作为研究对象，预测发现Nanos2是miR-34c的靶基因之一，构建其双荧光素酶报告基因载体及双荧光素酶报告基因突变载体验证靶基因，通过在分离的原代及传代SSCs中转染合成的miRNA模拟物、抑制物，及使用含有miR-34c慢病毒颗粒转导小鼠的曲细精管，检测、分析生殖细胞分化特异性标志基因的变化，深入研究了miR-34c对生殖细胞分化特异性标志基因的调控作用，研究结果证实miR-34c可能会通过靶向Nanos2以促进SSCs的分化。1.小鼠精原干细胞的分离和培养采集新生6至12dpp小鼠睾丸，去除白膜，用胶原酶和DNA酶消化使SSCs与睾丸支持(Sertoli)细胞分离。传代SSCs使用不同溶液及因子组合筛选培养体系，最终确定DMEM+15%KSR+0.25μmol L-1A83-01为无血清无饲养层最佳培养体系。在该培养体系下细胞传代，通过形态学观察、计数结合PCR、免疫荧光染色、BrdU掺入染色、AP染色等检测方法，对分离的SSCs特性进行鉴定后证实：该培养体系能够维持小鼠SSCs的自我更新，证明所培养的精原干细胞为典型SSCs。2.与小鼠精原干细胞发育密切相关的miR-34c靶基因的筛选、确定通过miRwalk (miRNA靶基因预测)网站，得到一系列miR-34c可能直接作用的靶基因，从中选择了一个与小鼠SSCs发育及精子发生密切相关的Nanos2基因。通过构建含有Nanos2-3’UTR及miR-34c预测结合靶位点突变Mut-Nanos23’UTR的双荧光素酶报告基因载体，与miR-34c共转染Hela细胞，测定双荧光素酶发光值。结果证实Nanos23’UTR与miR-34c直接结合，这提示miR-34c可能通过靶向Nanos2发挥作用。3. miR-34c在小鼠雄性精原干细胞精子发生过程中的作用通过向SSCs中转染合成的miR-34c模拟物和抑制物，以及含有miR-34c慢病毒毒液的培养液培养小鼠曲细精管，通过qRT-PCR技术及免疫荧光染色、Western blot、曲细精管的Whole-mount staining等方法检测减数分裂相关基因的表达变化。检测结果发现，过表达miR-34c后，Nanos2表达特异性显著下调，Scp3、Stra8等减数分裂后期标记基因的表达明显上调。以上实验结果表明，miR-34c可促进小鼠SSCs向精子细胞分化。